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土壤中烟草青枯病菌分子检测方法研究

吴金钟  
【摘要】: 烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt disease)是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害。R. solanacearum是一种分布范围广、危害大且难以防治的土传病原细菌,其随植株病残体遗落于土壤中成为植物青枯病的主要侵染源。该病菌主要从根部侵入,然后通过维管束传播,在极短的时间内引起整个植株的枯萎、死亡。由于目前缺乏特效的药剂和抗性品种,烟草青枯病的病后治理难度相当大,因此在发生前快速、准确地检测潜伏在田间土壤中R. solanacearum的数量是预防该病害发生的有效策略之一。传统上烟草青枯病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究即运用PCR技术,建立了土壤中R. solanacearum的常规PCR和实时荧光定量PCR(Real time PCR, RTi-PCR)检测体系,并初步研制出快速检测试剂盒。其研究成果将准确、快速地定量检测烟草种植田间土壤中的R. solanacearum和对田间病害发生情况进行动态监测,为烟草青枯病的防治提供有力依据,具有重要的生产意义和科学价值。论文主要研究结果如下: ①建立了烟草青枯病菌的常规PCR检测体系。利用序列比对得到的R. solanacearum独有核苷酸序列设计特异性引物对R.sol1/R.sol2,对PCR反应条件进行优化,建立了常规PCR检测体系,其DNA扩增靶带为331 bp。该检测体系特异性强、灵敏度高,检测灵敏度可以达到100 fg/μL,可用于土壤中R. solanacearum的检测。 ②改进了土壤中微生物总基因组DNA的提取方法,解决了土壤中腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重金属、不明沉淀物、菌体裂解成分和RNA等PCR抑制物质导致DNA不能直接用作PCR扩增模板的难题,采用此方法在2.5 h内提取得到可直接用于PCR扩增的高质量的土壤DNA。 ③首次建立了土壤中烟草青枯病菌的RTi-PCR检测体系。运用特异性引物对R.sol1/R.sol2优化建立了SYBR Green I RTi-PCR检测体系;利用引物探针设计软件设计TaqMan杂交探针RSprobe和特异性引物对R.sol1/R.sol2优化建立了TaqMan探针RTi-PCR检测体系;采用R.sol1/R.sol2扩增的331 bp片段构建的重组质粒梯度稀释液建立了RTi-PCR标准曲线。两种RTi-PCR检测体系对DNA重组质粒靶片段的检测灵敏度均可达1.2 fg/μL,比常规PCR的灵敏度高出两个数量级,可以准确地定量检测土壤中的R. solanacearum,实现了田间病害的早期诊断。 ④对来自田间的土壤样品进行了实际检测,证明了所建立的PCR检测体系是稳定可靠的。分别采用两种PCR检测体系对来自重庆彭水、黔江、酉阳等地35个田间土壤样品进行实际检测,结果与田间发病情况基本一致,证明所建立的PCR检测体系是稳定可靠的。 ⑤初步研制了快速检测试剂盒。采用核酸、酶的稳定剂结合真空冷冻干燥技术初步制备出R. solanacearum的分子检测试剂盒,可常温保存和储运,即开即用、操作简便,有利于实现R. solanacearum的快速检测。


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