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转基因内皮细胞修饰血管内支架的实验研究

唐朝君  
【摘要】: 冠状动脉内植入支架已成为治疗冠心病的重要手段。然而,支架植入不能抑制新生内膜增生,支架内再狭窄(In-stent restenosis, ISR)的发生率仍有(13-20)%。目前,防治支架内再狭窄的研究热点在于药物洗脱性支架,而该支架植入后出现的一些问题已引起广泛关注:如晚期支架血栓形成,支架涂层材料的不良病理作用,内皮化延迟、动脉瘤、支架贴壁不全等。促进损伤血管愈合、加速支架完全再内皮化过程是解决问题的一条有效途径。 因此,内皮细胞(Endothelial Cell, EC)在再狭窄形成过程中的作用越来越受到重视。内皮细胞移植能替代、修复受损内皮的功能并抑制内膜过度增生。体外培养的内皮细胞由于生长环境的改变,导致生长缓慢和其他生物特性的丢失,结合基因治疗,有望通过对体外培养的内皮细胞稳定转染生长因子,提升细胞的增殖能力;结合动态培养,有望促进内皮细胞在血管内支架表面的粘附和生长;结合模拟体内循环系统实验,有望控制细胞支架在输送过程中的损耗,保障动物实验结果的真实可靠性。本研究就是基于上述思路开展的应用基础研究,即转基因内皮细胞支架的初期研究。 在本课题研究研究中,采用阳离子脂质体DOTAP对传代培养的人脐静脉内皮细胞稳定转染血管内皮生长因子VEGF121;并以此转基因内皮细胞为研究对象,设计并制作了用于血管内支架表面种植细胞的旋转培养装置,通过对旋转速度、旋转时间、细胞种植密度和重复旋转的次数这些影响因素的分析,寻找出了粘附效果最好的条件组合;用超声雾化喷涂法方法制备用于细胞粘附的蛋白涂层,并用扫描电镜和能谱测试仪检测制备好的蛋白涂层;根据得到的最佳旋转培养条件制备转基因内皮细胞包被支架,通过扫描电镜检测,旋转培养后血管内支架表面粘附的细胞数量和铺展情况,免疫荧光检测支架表面粘附的细胞表达VEGF蛋白的情况;体外流动腔实验检测经过传输的损耗和流动剪切力的作用后,转基因内皮细胞在血管内支架表面的粘附和生长情况;最后通过兔腹主动脉支架植入术的动物模型检测转基因内皮细胞包被支架的在体抗再狭窄和抗血栓的效果。 研究结果如下:1)通过RT-PCR和免疫细胞化学鉴定,成功建立转VEGF基因人脐静脉内皮细胞系;2)通过对旋转速度、旋转时间、细胞种植密度和重复旋转的次数这些影响因素的分析,寻找出了粘附效果最好的条件组合,当细胞种植密度为1×105cells/ml,旋转时间为6h,旋转速度为0.4rpm时,旋转培养粘附的细胞数量最多;3)制备明胶浓度为2-6mg/ml,多聚赖氨酸为10μg/ml的混合溶液,用超声雾化喷涂法方法得到的蛋白涂层经检测在支架表面涂覆紧密、均匀;4)通过优化的旋转培养条件制备出转基因内皮细胞覆盖的血管内支架,在光学显微镜和扫描电镜下观察,细胞在支架表面粘附生长,荧光显微镜检测细胞高表达VEGF蛋白;5)体外流动腔实验检测发现,转基因内皮细胞在模拟体内传输过程中,将有部分细胞损失,但是在不同的切应力作用下,转基因内皮细胞又很快的恢复生长;6)动物实验结果发现与两个对照组相比,细胞包被支架均极显著的抑制了内膜增生和降低了支架内再狭窄。 综上所述,本研究初步解决了血管内支架的细胞种植方法,提出一种组织工程血管内支架的实验室制备方法和检测方法,得到的相关实验结果为细胞种植防治血管内支架再狭窄的临床应用提供实验依据。内皮细胞种植支架预防再狭窄的研究已显示出诱人的前景,随着进一步的深入研究,相信将会开辟出一片新的领域。


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