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钛表面改性及其对间充质干细胞成骨分化的影响

张燕  
【摘要】:由于钛及钛合金优越的生物相容性和力学性能,被广泛应用于骨科、牙科等领域。然而由于钛及钛合金表面的生物惰性,缺乏诱导骨生成的潜能,且无法与周围骨组织形成有效的骨键合。因此本文以钛表面二氧化钛纳米管为储存器,采用多种骨生长相关生物因子对钛进行表面改性,通过成骨细胞和间充质干细胞体外培养实验,评价表面改性钛的成骨能力,研究其作用机理。本工作可丰富骨植入材料-组织间相互作用理论,并为开发骨诱导性金属材料提供新的实验基础。本论文内容分为四个部分。为了研究不同纳米拓扑结构和成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)对成骨细胞的影响,利用阳极氧化方法在钛表面构建不同管径的二氧化钛纳米管,并选取1OOnm直径的纳米管吸附OGP,进行成骨细胞的培养。X射线能量色散谱仪(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy,EDS)和X射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)分析证实OGP成功地装载到了材料表面和内部。体外成骨细胞培养实验表明,除纳米管管径尺寸对成骨细胞行为有影响外,吸附了 OGP的纳米管既有利于成骨细胞粘附、增殖,又对细胞的分化起到了促进作用。因而,采用钛表面吸附OGP方法简便,且更有利于成骨细胞生长,具有促进骨生成的能力。其次,以间充质干细胞(MSCs)培养基中常用诱导因子改性钛表面纳米管层,研究携载不同诱导因子的纳米管对MSCs的影响。在真空条件下,选用100nm管径的纳米管层分别吸附地塞米松、β-甘油磷酸钠、骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和OGP,然后进行体外MSCs的培养。结果表明,四种成分均成功的吸附在纳米管表面。纳米管作为储存器携载β-甘油磷酸钠的材料在细胞培养初期不利于细胞的粘附,但提高了部分成骨相关基因的表达;携载地塞米松的纳米管对细胞前期的增殖有促进作用,提高了 Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)和骨桥蛋白(OPN)的表达量和钙含量;以OGP改性有利于细胞的粘附和增殖,但对干细胞的成骨分化没有明显影响;而携载了 BMP-2的纳米管有利于细胞的粘附和增殖,且碱性磷酸酶(alkline phosphatase,ALP)活性、两种特异性蛋白、钙含量和成骨相关基因的表达都比其他组要高。表明材料表面不同的诱导因子可能经由不同的途径作用于MSCs的成骨分化过程,从而显示出不同的促进能力。其中,钛表面纳米管携载BMP-2对干细胞的增殖和分化具有最为明显的促进作用。再次,研究不同管径的纳米管层装载BMP-2后对MSCs成骨分化的影响。XPS和EDS分析发现BMP-2成功装载到了纳米管的表面和内部。释放研究表明,100 nm纳米管试样中BMP-2的释放量要大于另外两组管径试样。携载了 BMP-2的50 nm纳米管较其他组更能促进细胞粘附和增殖,100 nm纳米管携载BMP-2后更有利于细胞迁移,提高了细胞的ALP活性、特异性蛋白表达、成骨相关基因和钙含量。因此,100 nm管径纳米管的拓扑结构和BMP-2协同作用更有效地促进了 MSCs的成骨分化。最后,在装载BMP-2的纳米管上,引入壳聚糖(CS)、BMP-2两种阳离子型聚电解质和一种阴离子型聚电解质DNA,用层层组装的方法制备多层膜,以实现BMP-2的控制释放及长效作用。扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)、XPS、接触角和多层膜降解实验结果显示,CS、BMP-2、DNA通过静电吸附形成了 100nm厚的多层膜。仿生条件下的降解与释放实验表明,14d时,多层膜的降解已经使纳米管基底裸露出来;到21d时,大部分的多层膜已经降解;细胞培养实验结果显示,多层膜不利于细胞初期的粘附但利于细胞的增殖;ALP测定、聚合酶链式反应(PCR)分析、Col-1和OPN的染色结果表明,多层膜能显著提高MSCs的成骨分化,且随着多层膜的降解,管内BMP-2和纳米管能够协同地持续促进干细胞的成骨分化。因此,钛表面纳米结构化与层层组装技术结合,是制备骨诱导金属材料的简便而有效的手段,也可为其他药物控释系统的研究提供参考。


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