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APS对P.acnes诱导的NF-κB信号通路及细胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α的影响

邓秋  
【摘要】:目的:探讨L-抗血酸-2-磷酸盐(L-ascorbyl-2-phosphate,APS)是否可以抑制痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes,P.acnes)诱导的核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路,从而减少皮脂腺细胞分泌的细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),这样有助于我们更充分地了解痤疮炎性反应的作用机制,为痤疮的治疗提供一些新的思路。方法:1、SZ95人皮脂腺细胞的培养:复苏细胞,进行细胞培养传代,待细胞长到一定程度,冻存细胞。2、按照说明书活化并培养痤疮丙酸杆菌,挑取经鉴定为痤疮丙酸杆菌的菌落,用不同浓度的APS溶液配置成细菌悬浮液,每次现配现用。3、CCK8方法检测SZ95人皮脂腺细胞的增殖情况:加入不同浓度的APS后,24h后检测细胞增殖情况。4、使用P.acnes悬浮液刺激SZ95人皮脂腺细胞24h后,采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system,RT-PCR)、酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-1β、IL-8、TNF-α的表达情况,使用免疫印迹法(western blot,WB)检测细胞质p-IκBα、细胞质以及细胞核NF-κB p65蛋白的表达情况。5、加入含有痤疮丙酸杆菌的不同浓度的APS溶液,24h后采用RT-PCR、ELISA方法检测IL-1β、IL-8、TNF-α的表达情况,WB检测细胞质p-IκBα、细胞质以及细胞核NF-κB p65蛋白的表达情况。结果:1、复苏的SZ95人皮脂腺细胞培养4天左右,置于倒置相差显微镜下观察,发现细胞铺满培养瓶瓶底,沿着培养瓶贴壁生长,培养2到3天左右进行传代,一般传代后3天左右细胞长满培养瓶瓶底。2、在37℃的厌氧环境中,痤疮丙酸杆菌孵育48小时后,可见血平板上长出灰白色、形态较一致的菌落。3、APS的浓度在1.5625mmol/L–12.5mmol/L范围内,与SZ95人皮脂腺细胞共培养24h,可以促进SZ95人皮脂腺细胞的增殖,而APS的浓度在25mmol/L–200mmol/L范围内,可以抑制SZ95人皮脂腺细胞的增殖,统计学上有显著性差异(P0.01),因此在1.5625mmol/L–12.5mmol/L范围内筛选出适宜的APS浓度2.5 mmol/L、5mmol/L和10 mmol/L,且APS浓度越高,细胞的吸光度值越大,差异具有显著性意义(P0.01)。4、P.acnes悬浮液刺激SZ95人皮脂腺细胞24h后,RT-PCR、ELISA方法检测SZ95人皮脂腺细胞产生的IL-1β、IL-8、TNF-α值较空白对照组均有不同程度增加,统计学上有显著性差异(P0.01);WB检测SZ95人皮脂腺细胞产生的细胞质p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达升高,高于空白对照组,而细胞质NF-κB p65蛋白的表达较空白对照组降低。5、含有痤疮丙酸杆菌的APS溶液共同处理SZ95人皮脂腺细胞后,RT-PCR法、ELISA法检测SZ95产生的IL-1β、IL-8、TNF-α值较P.acnes组均有不同程度降低,且降低程度具有浓度依赖性,APS的浓越高,IL-1β、IL-8、TNF-α的降低程度越明显,差异具有统计学意义(P0.05);WB检测SZ95人皮脂腺细胞产生的细胞质p-IκBα和细胞核NF-κB p65蛋白表达降低,低于P.acnes组,且APS的浓度越高,p-IκBα和NF-κB p65的蛋白表达量越低,而细胞质NF-κB p65蛋白表达有所升高,高于P.acnes组,且APS的浓度越高,细胞质NF-κB p65蛋白的表达量越高。结论:1、P.acnes可以诱导SZ95人皮脂腺细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α;2、P.acnes可以通过NF-κB信号通路促进SZ95人皮脂腺细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α;3、APS可以抑制P.acnes诱导的NF-κB信号通路从而减少SZ95人皮脂腺细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α。


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