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卤醇脱卤酶红外及荧光探针标记及其结构动力学研究初探

堵瑄  
【摘要】:卤醇脱卤酶不仅能够降解环境中存在的有机卤化物,还能合成具有手性的环氧化物和β-取代醇,其催化机理和广泛的应用前景近年来备受关注。卤醇脱卤酶的动态结构变化与其生物功能紧密相连,是卤醇脱卤酶发挥功能的重要结构基础,对其结构动力学的研究有助于揭示卤醇脱卤酶的催化反应机理,以及提升酶的改造效率。众所周知,光谱技术在研究酶蛋白结构的动态性方面具有广泛应用,相关研究需要在酶蛋白中嵌入合适的光谱探针,因此探针对酶蛋白的标记就显得尤为重要。本研究结合了生物学技术和光谱技术,将红外、荧光探针位点特异性的嵌入卤醇脱卤酶中,探针标记卤醇脱卤酶的位点不受局限,对所处的微环境非常敏感,且能精准地反映出酶蛋白动态结构的微小变化,在蛋白质结构动力学研究中具有显著优势。本研究应用密码子扩展法将非天然氨基酸Naek引入HheC的K140,K161,P184三个位点,通过优化表达体系和亲和层析得到了叠氮基团修饰的酶蛋白,并进行了酶催化特性及红外光谱检测。实验结果表明:(1)184~+突变体的酶活最佳,并且具有与野生型相当的热稳定性、最适反应温度;(2)由于探针所处微环境的极性不同,K140,K161,P184三个突变体的红外特征峰分别位于2131 cm~(-1),2137 cm~(-1),2183 cm~(-1)波数处,并且叠氮的峰位会随着溶液极性的强弱而变化;(3)高浓度盐酸胍溶液使酶蛋白结构趋向统一,其红外特征峰变窄,分布更为集中。然而,红外光谱检测氯离子结合后酶的构象变化不够灵敏,因此在后续实验中尝试用荧光手段探究卤离子对卤醇脱卤酶构象的影响在上述研究基础上,通过SPAAC环加成点击反应,将含有炔烃的化学荧光染料DBCO-CY_5位点特异性的连在卤醇脱卤酶上,进行了酶活力和荧光光谱检测;研究还通过定点突变构建了卤醇脱卤酶的单色氨酸突变体。实验结果表明:(1)卤醇脱卤酶的外源荧光嵌入效率可以达到49.03%,突变体在670 nm处有最大荧光发射峰,最大荧光强度为1469,并且点击反应过程不会损失酶活力;(2)在卤离子结合实验中,Cl~-和Br~-与卤醇脱卤酶的结合能够影响其外源相对荧光强度,而F~-却不能影响酶蛋白的外源荧光强度,这也说明184位点参与了酶蛋白在行使催化功能时的构象变化。综上所述,本研究成功构建了卤醇脱卤酶的红外和荧光探针,为后续研究卤醇脱卤酶的结构动力学奠定了基础。


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