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水稻支链淀粉合成途径基因定向突变体创制及分析

李倩  
【摘要】:水稻(Oryza sativa)是世界上重要的粮食作物。随着人们生活水平的提高,对稻米品质的需求有了更高的要求。淀粉是水稻胚乳的主要成分,是影响稻米品质的主要因素之一。淀粉的合成是由多种酶参与的网络调控过程,对其生物合成途径相关酶的研究是优化稻米品质的重要策略。稻米胚乳中支链淀粉和直链淀粉的比例约为3:1,两者的比例关系是水稻品质优劣的重要因素。本研究利用实验室高效的CRISPR-Cas9系统,针对水稻支链淀粉合成途径关键基因构建了定向编辑载体,将构建的载体通过根癌农杆菌介导的稳定转化,获得靶位点突变的T_0转基因植株,并在获得的T_1代中筛选出靶位点双等位基因突变且不含外源片段插入的水稻突变体材料,快速获得支链淀粉合成途径相关基因的突变体库,进一步明确支链淀粉合成途径每个基因的功能及对支链淀粉合成的影响,以期改良胚乳淀粉含量和结构,为水稻品质育种提供理论基础。主要研究结果如下:1、针对水稻支链淀粉合成途径基因的SS家族,SBE家族和DBE家族,共构建了13个定向编辑载体pQL05-pQL11、pQL13-pQL14、pQL16-pQL19。在每个基因的编码区设计了两个紧邻的不同sgRNA1与sgRNA2位点,以提高基因突变的概率,确保突变材料的成功创制。2、通过根癌农杆菌介导的遗传转化,SS基因家族中,OsSSI基因、OsSSIIa基因、OsSSIIIa基因和OsSSIVa基因分别获得了22株、21株、23株和26株转基因阳性植株。对靶位点的检测鉴定,结果显示分别获得了21株、15株、19株、18株突变体材料,总突变率为71.43%-95.48%,其中单个sgRNA的突变效率为28.57%-90.90%。3、针对SBE基因家族稳定转化得到的再生植株进行鉴定,OsSBEI基因、OsSB-EIIa基因、OsSBEIIb基因的转基因阳性率为100%,分别得到了16株、16株、15株转基因阳性植株,对其靶位点分别进行鉴定,结果表明突变率为56.25%-93.75%,单个sgRNA的突变效率为43.75%-93.75%,分别获得了9株、15株、14株突变体材料。4、经水稻稳定转化,关于DBE基因家族中OsISA1基因共检测了15个单株,得到了15个转基因阳性单株,转基因阳性率为100%,对靶位点鉴定发现,总的突变效率为100%,共获得了15株突变体材料。OsPUL基因共检测了23个单株,转基因阳性率为100%,对其两个目标位点鉴定分析,共获得了21株突变体材料,突变效率为95.45%。5、通过对基因OsSSI、OsSBEI、OsSBEIIa和OsPUL的突变体T_1种子外观性状观察,发现OsSBEIIa基因T_0代突变体pQL08-16-1株系的糙米籽粒大小变小,透明度明显降低;OsSSI基因、OsPUL基因、OsSBEI基因T_0代突变体株系的糙米粒长比WT明显变大,粒宽变小。后续将进一步对T_2代突变体进行分析鉴定。6、对基因OsSSI、OsSBEI、OsSBEIIa和OsPUL的突变体材料的T_1代植株进行鉴定和筛选,最终获得了靶位点双等位基因突变,且不含外源片段插入的植株材料,成功获得了支链淀粉合成途径SS、SBE、DBE基因家族成员的突变体库,为深入研究淀粉合成基因的功能提供了基础。


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