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猪肺中有效生物活性物质的提取、分离与性质研究

张晓娟  
【摘要】:猪肺含有蛋白质、脂肪、维生素B1、维生素B2、磷、钙、铁等人体所需的营养物质,但目前大多数猪肺都没有得到很好的利用,或者以食料的形式零星出售,或者直接丢弃,附加值相当低。开发利用猪肺不仅能够增加用于食品、药品等行业的原料资源,提高猪肺的综合利用率,而且能够有效减少屠宰场废弃物对周围生态环境的污染,具有良好的经济和社会效益。本论文以猪肺为原料提取肝素钠、抗氧化肽和蛋白质,并对这三种物质的相关性质进行分析。主要研究内容及结果如下:(1)肝素钠的提取、分离与纯化。以己糖醛酸提取率为指标,在单因素条件基础上,通过响应面优化分析,得到肝素钠的最佳工艺条件为:提取温度53℃,时间4 h,p H=8.5,在此条件下,己糖醛酸提取率为5.49%,粗品肝素钠提取率为0.81%,效价为6.5 U/mg,经过沉淀剂除蛋白质、乙醇沉淀,以及DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱层析纯化得到高纯度的肝素钠,提取率为0.05%,效价为1 0 8.3 U/m g。(2)肝素钠性质研究。经琼脂糖凝胶电泳分析得到纯化物与标准品的迁移距离和斑点基本一致。红外图谱分析纯化物在890 cm-1和9 4 0 c m-1处存在肝素钠的特征吸收峰。紫外图谱分析纯化物在260 nm和280 nm处无明显吸收峰,在207.5 nm处有最大吸收峰。核磁共振波谱分析纯化物,在1H-N M R中,乙酰氨基葡萄糖的H 1出现在δ=5.53处;硫酸化艾杜糖醛酸的H1出现在δ=5.19处;2-硫酸-艾杜糖醛酸(Glc Ns6s)的H5出现在δ=4.93处;6-硫酸-N-硫酸-葡萄糖胺(Glc NS6S)的H4出现在δ=3.61处;N-硫酸化氨基葡萄糖的H1出现在δ=3.30处;N-乙酰氨基葡萄糖的甲基出现在δ=2.05处。在1 3C-N M R中,单元G l c N s 6 s中的C-2的δ=57.95,而单元I d o A 2 s中的C-2的δ=75.74,单元Ido A2s中的羰基碳C-6的δ=174.65。(3)抗氧化肽的提取、分离与纯化。以D P P H自由基清除率为指标,在单因素条件基础上,通过响应面优化分析得到抗氧化肽的最佳工艺条件为:料液比1:3,水解6 h,酶浓度为6500 U/g,在此条件下DPPH自由基清除率为66.89%,粗品抗氧化肽提取率为9.78%。经过葡聚糖凝胶Sephadex G-50、G-25和G-10分离纯化后,得到体外抗氧化活性最强的组分C5,其提取率为1.29%,通过液相色谱-质谱联用测得C5组分的分子量为452.00 Da。(4)抗氧化肽的性质研究。紫外图谱分析C 5组分在2 2 4 n m处有单一的吸收峰。由扫描电镜可知,C5组分呈块状,表面较为光滑。C 5组分的红外图谱显示1 4 0 2 c m-1左右为羧基的弯曲振动吸收峰,是羧基存在的信号;3427 cm-1是胺基存在的信号,1405 cm-1左右为羟基的面内弯曲振动,是羟基存在的信号;1640 cm-1左右为羰基的信号。C5组分清除DPPH自由基、超氧阴离子、ABTS自由基和羟基自由基的EC5 0分别为0.073 mg/m L、0.989 mg/m L、0.192 mg/m L和1.2 6 1 m g/m L,金属螯合能力的E C5 0为6.505 mg/m L。(5)蛋白质的提取与性质研究。以蛋白质提取率为指标,在单因素条件基础上,通过响应面优化分析得到蛋白质的最佳工艺条件为:料液比1:3,提取时间为1.5 h,p H=9.7,此时,蛋白质提取率可达8.2 8%。经紫外光谱分析得到该物质在2 7 9 n m处有明显吸收峰。猪肺蛋白质经氨基酸自动分析仪测定,得到其含有十八种氨基酸,主要氨基酸种类为:谷氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、精氨酸和缬氨酸,其中亮氨酸和缬氨酸是人体不能合成的氨基酸。同步热分析显示,蛋白质在200℃附近开始发生降解,到650℃降解基本完成,具有良好的热稳定性。由扫描电镜可知,蛋白质呈长条形且无规则卷曲,表面较为光滑。


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