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基于慈竹转录组MYB转录因子克隆及其遗传转化研究

杨传凤  
【摘要】:慈竹为丛生竹类,属禾本科竹亚科慈竹属,其纤维含量高,是西南地区造纸重要原料,但慈竹本身较高的木质素含量及冷冻胁迫、土壤干旱等影响,造成慈竹大面积减产。MYB基因在调控植物次生细胞壁合成及响应各种非生物胁迫中发挥重要作用。本研究基于慈竹笋转录组数据库,克隆得到2个MYB基因,并对其进行生物信息学分析、组织表达模式分析和胁迫诱导表达分析及过表达载体遗传转化烟草,为通过基因工程手段提高工业用竹的抗逆性研究和调控木质素生物合成研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.从100cm高慈竹笋转录组数据库中筛选2条MYB序列,设计全长引物,以转录组测序用慈竹笋cDNA为模板克隆得到2个MYB全长基因序列,分别命名为BeMYB1和BeMYB2,序列提交至NCBI数据库,其GenBank注册号分别为KJ496128和KJ496129。2.生物信息学分析结果表明,BeMYB1和BeMYB2基因cDNA全长序列分别为2061 bp和1142 bp,编码区分别为1899 bp(编码632个氨基酸)和1017bp(编码338个氨基酸)。慈竹BeMYB1和BeMYB2基因编码的蛋白均为亲水性蛋白,分别具有10个和12个磷酸化位点及13个和5个赖氨酸糖基化位点。氨基酸序列分析表明,BeMYB1基因编码蛋白C端具有一个MYB结构域,与小麦TaMYB48具有较高的相似性,均具有2个保守的motif 1和motif2基序,属于MYB相关蛋白;而慈竹BeMYB2基因编码蛋白在N端具有2个MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白亚族,与毛竹PeMYB2和水稻OsMYB18聚为一支,均具有3个保守的motif 1、motif 2和motif 3基序。3.采用Real-time PCR技术对慈竹MYB基因的组织表达模式进行分析,结果表明,慈竹BeMYB1和BeMYB2在慈竹笋、叶、茎部位均表达,属于组成型表达,但二者的表达量均在成熟的组织中较高,BeMYB1主要在茎下部表达,BeMYB2主要在展开叶和未展开叶中表达,而幼嫩的笋中表达量均很低,且BeMYB2基因在各部位的表达量较BeMYB1高。4.对慈竹幼苗进行ABA(200μmol?L–1)、NaCl(200 mmol?L–1)、PEG6000(20%)胁迫处理,通过Real-time PCR技术对BeMYB1和BeMYB2基因进行胁迫诱导差异性表达分析。结果表明,与对照相比,短时间内同一种非生物胁迫下,BeMYB2基因的表达量变化幅度较BeMYB1基因大,尤其是干旱胁迫。因此,推测BeMYB1和BeMYB2基因可能在应答ABA、高盐胁迫、干旱的胁迫时发挥重要作用。5.构建了BeMYB1和BeMYB2的植物过表达载体pCAMBIA 1303-BeMYB1和pCAMBIA 1303-BeMYB2,并将pCAMBIA 1303-BeMYB1和pCAMBIA1303-BeMYB2载体成功转化烟草,均得到转基因烟草植株。转基因植株的初步分析结果表明,与CK相比,pCAMBIA1303-BeMYB1转基因株开花延迟、茎杆粗壮、植株较高,木质部较宽,木质素含量降低;而pCAMBIA 1303-BeMYB2植株与对照相比,其株高无明显差异,开花也与对照在同一时期,没有延迟或提前。同时也构建了pCAMBIA 2301-MYB1-RNAi和pCAMBIA2301-MYB2-RNAi干扰载体。


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