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柠檬生物活性成分分析及其组织培养技术研究

李鹏飞  
【摘要】:柠檬果实中生物活性成分种类多,含量丰富。随着经济的高速发展和人民生活品质的提高,越来越多的研究人员关注柠檬,研究柠檬果实中的生物活性成分在抗菌、抗癌、抗衰老、抗氧化、降血糖血脂等方面的功效。伴随着各项柠檬相关的研究,运用快繁技术改良果实品质成为柠檬种植业的发展的必由之路,柠檬相关领域的保健品研究与开发正在兴起。本论文对柠檬快繁技术进行了初步的探索研究,并对柠檬中总膳食纤维、多酚类物质、黄酮类物质、柠檬苦素、主要金属元素含量进行了分类测定,对柠檬活性多肽进行了初步研究。 本文采用酶重量法,运用凯氏定氮法和灰化法测定了蛋白质和灰分的含量,定量测定了柠檬果实匀浆液中膳食纤维的含量。结果柠檬果实匀浆液膳食纤维含量为21.9mg/g,精密度和重复性表现良好,相对标准偏差7.01%。 采用Folin-Ciocalteu比色法对柠檬匀浆液总多酚含量进行测定。多酚标准品在浓度为0.1mg/mL-1.0mg/mL范围内线性关系良好,标准曲线R2=0.999。测定柠檬果实匀浆液提取液总多酚含量为1.224mg/mL,其中稀释250倍、50倍、25倍的提取液的加标回收实验精密度和重复性良好,RSD分别为:8.43%、2.27%、1.67%。 试验对柠檬总黄酮的含量进行了测定,其中黄酮标准品质量浓度在0-25ug/mL范围内线性关系良好,R2=0.9979。测定得到柠檬中总黄酮的含量为377.6ug/mL,方法精密度和重复性良好,RSD为6.6%。 实验利用超声波提取的方法对柠檬中柠檬苦素进行提取,紫外分光光度法和高效液相进行成分分析和检测。其中,柠檬苦素标准品浓度在40mg/L-80mg/L范围内线性关系良好,R2=0.999。柠檬果汁未检测出柠檬苦素。柠檬籽中其含量为61.04mg/L,重复性和精密度实验RSD分别为1.84%、1.93%。 初步对柠檬中多肽进行分离及检测,并对5KD-30KD多肽进行超滤离心管截留。双缩脲显色反应颜色变化为由无色到浅蓝色,最后为紫色,表明有多肽或蛋白质。经SDS-PAGE结果显示:柠檬多肽样品在10kD-15kD范围内出现了条带,且条带随进样量增加逐渐加深;经反相高效液相色谱洗脱柠檬多肽粗提物与重组人胰岛素标准品,结果显示在几乎相同的保留时间有吸收峰出现。并对柠檬多肽样品进行梯度洗脱条件选择,结果良好流动相流速为0.8mL/min,0-1min:A液为:90%、B液为10%;1-30min:A液为40%、B液为60%。 同时,对柠檬中铜、锌、铁、硒四种微量元素进行了测定。柠檬果实不同部位按照特定的消解程序进行消解,铜、锌、铁三种元素在最佳原子吸收光谱仪工作条件下,采用火焰原子吸收光谱法对其含量进行测定。柠檬果实中,不同部位中铜、锌、铁含量分别为:柠檬果汁:0.709μg/kg,1.244μg/kg,14.312μg/kg;柠檬果皮0.787μg/kg,2.430μg/kg、12.971μg/kg;柠檬籽:3.384μg/kg,5.948μg/kg,29.773μg/kg。相对标准偏差(RSD%)在在0.44%-1.19%之间,加标回收率在在98.6%-108.3%之间,重复性实验相对标准偏差铜锌、铁分别在1.31%-7.58%。试验结果良好。采用原子荧光光谱法测定硒的浓度,标准品浓度在1.0μg/L-32μg/L范围内线型关系良好(R2=0.9998),精密度实验RSD为0.26%,加标回收率为80.0%-112.5%之间。样品不同部位硒的含量分别是:果汁0.0030μg/L,果皮0.0005μg/L,柠檬籽0.0014μg/L。 利用响应面法探索研究了柠檬快繁技术,并探究了组织离体培养的培养条件、诱导愈伤组织培养基和生根培养基。得到了优化的培养方案:6-BA浓度等于1.95mg/L、GA浓度为1.46mg/L、IBA浓度为0.97mg/L;NAA浓度等于0.40mg/L、BA浓度为1.76mg/L、活性炭添加量为2.12mg/L;培养时间为10.7h、培养温度为35℃、光照强度为1712Lx,湿度50%。


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