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基于抗氧化、骨免疫调节策略研究纳米鱼骨在骨组织工程中的应用

黄丽萍  
【摘要】:在过去,绝大多数的骨移植材料的设计和评价都遵循着类似的研究思路:首先研究骨移植材料在体外对成骨细胞的成骨分化作用,然后将其移植至体内进行成骨评估,最后进入临床试验。基于这种传统的研究思路所研发的骨移植材料获得了一定的成功,但存在临床的骨再生结果与实验室研究结果不一致的情况。近年来,骨免疫学的提出表明免疫细胞在骨再生过程中起着至关重要的作用,而传统的研究中忽略了这一点,这可以为体内的实验结果与体外实验结果不一致提供解释。基于此,本文提出骨免疫调节策略以研究骨生物材料在骨再生过程中对免疫反应及成骨的影响,通过选取具有良好生物性能的明胶作为基体,引入动物源性的纳米鱼骨制备成复合水凝胶,研究其骨免疫调节能力和骨再生效果。此外,因为氧化应激也会对免疫反应和骨再生产生影响,所以本文将骨移植材料辅以抗氧化性,由此调节免疫反应以促进更好的骨再生。通过将具有抗氧化性能的精氨酸与纳米鱼骨相结合,形成纳米复合物,研究其骨免疫调节能力及成骨效果。骨生物材料除了具有促进骨再生的能力外,还应当考虑骨免疫调节能力,本文首先选取明胶为基体引入纳米鱼骨研究其对免疫微环境和成骨的调节。鱼骨是鱼类加工过程中的主要副产物,来源广泛、价格低廉,并且富含有丰富的矿物元素如钙、镁、磷、硅等,以及活性物质和胶原蛋白。而鱼骨的这些特质具有作为骨修复材料的基本特征。本文基于前人制备微米鱼骨的基础上通过高能湿法球磨法和球磨机处理后获得纳米鱼骨(NFB)并探索它在骨组织工程中的应用。NFB的扫描电镜显示NFB颗粒呈球形,粒径分布均匀,且呈纳米级别;电荷结果显示NFB带负电荷。这些结果可初步判定纳米鱼骨其在骨组织工程具有一定潜在能力。在对纳米鱼骨进行基本的材料表征后,本文进一步将纳米鱼骨在骨修复应用中的可行性进行挖掘。根据纳米鱼骨的特性,本文将纳米鱼骨与甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)复合,成功制备了甲基丙烯酸酯化明胶/纳米鱼骨复合水凝胶(Gel-MA/NFB hydrogels)并将其作为骨修复支架进行研究。理化性能表征显示,随着纳米鱼骨的添加比例增加,所形成的复合水凝胶的颜色逐步加深,孔径约为10~50μm;储能模量随NFB的添加比例增加而升高。体内细胞相容性实验结果表明Gel-MA/NFB复合水凝胶没有毒性并且都能促进细胞增殖。细胞染色结果表明细胞能够很好的黏附和生长在Gel-MA/NFB复合水凝胶上。而在进行体外成骨成血管研究前,由于免疫反应对成骨具有很大的影响。我们首先对巨噬细胞长在材料上的形态进行表征,结果表明Gel-MA/NFB复合水凝胶能够刺激巨噬细胞极化,表现出不同的形态。随后对巨噬细胞在材料上释放的因子和蛋白进行表征,结果表明促炎症因子的表达随纳米鱼骨的添加比例增加呈现为先增加后抑制的现象。而进一步用Gel-MA/NFB复合水凝胶刺激巨噬细胞产生的巨噬细胞条件培养基和Gel-MA/NFB复合水凝胶对成骨细胞的影响,结果显示NFB添加比例增加,钙结节,碱性磷酸酶活性(ALP),成骨和成血管的因子和蛋白表达增加。这表明通过调节免疫微环境可以促进骨生成。为了验证体外细胞实验与体内实验结果的一致性,进行了大鼠颅骨修复手术,结果表明炎症的表达和成骨结果与体外实验结果一致能够促进骨再生。以上实验结果表面,本研究成功构建了具有能够调控免疫微环境和促进成骨的Gel-MA/NFB复合水凝胶并在大鼠的骨修复应用中取得了良好的效果。此外在植入手术过程中,由于在钻孔时会发生一系列复杂反应产生大量自由基,一些自由基与氧反应产生氧自由基代谢物。而这些氧自由基代谢物不能及时清除时,会造成体内过多的活性氧产生。这些活性氧会损伤细胞的粘附甚至导致细胞凋亡而影响骨修复效果。基于此,本文通过增加纳米鱼骨的抗氧化性和免疫调节能力来研究其在骨修复应用中的效果。精氨酸是体内的必需氨基酸,具有良好的生物相容性和抗氧化性能,且带正电荷。因此本文通过精氨酸和纳米鱼骨之间的静电作用制备精氨酸/纳米鱼骨复合材料(Arg/NFB纳米复合物)研究其在骨组织工程中的应用。理化性能结果显示,Arg/NFB纳米复合物扫描电镜结果呈立方形。粒径结果分析显示,纳米鱼骨与精氨酸结合后粒径分布大幅度降低。通过XPS表征发现,精氨酸与纳米鱼骨成功结合。体外抗氧化性能结果显示,精氨酸的引入能够使纳米鱼骨具有较好的DPPH清除能力.体外抗氧化细胞实验结果表明,Arg/NFB纳米复合物能够使细胞具有更好的ROS清除能力。材料与巨噬细胞作用研究其对免疫微环境的影响。对巨噬细胞的进行形态表征结果显示Arg/NFB纳米复合物能够促进巨噬细胞极化且巨噬细胞长在Arg/NFB纳米复合物材料上有更多的伪足和长梭形的细胞呈现。对巨噬细胞受材料刺激后产生的抗炎,炎症因子和蛋白的表达的检测显示,Arg/NFB纳米复合物材料可以显著的降低炎症因子的表达,提高抗炎因子白介素-10(IL-10)的表达。随后研究Arg/NFB纳米复合物刺激巨噬细胞后产生的巨噬细胞条件培养基和Arg/NFB纳米复合物对成骨和成血管的调节作用。结果显示,对比单纯的纳米鱼骨,Arg/NFB纳米复合物组的钙结节,ALP,成骨和成血管的因子和蛋白表达增加。体内动物实验结果表明,炎症表达和成骨结果与体外细胞实验结果一致,Arg/NFB纳米复合物能够促进骨再生。以上结果表明,本研究成功构建了具有抗氧化活性和免疫调节成骨的Arg/NFB纳米复合物并在大鼠颅骨修复应用中取得良好的治疗效果。综上所诉,本文通过免疫反应来调节骨免疫微环境以促进骨再生的策略是一种有效的调节策略,并进一步辅以抗氧化能力以调节骨免疫微环境促进成骨的策略这对后期研发骨移植材料以及更好地预测材料的骨修复效果提供重要的指导意义。


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