棉花纤维发生的AFLP分子标记

【摘要】： 利用突变体是研究基因及其功能的有效手段。徐州142无绒无絮 （fuzzless-lintless,fl）是纤维发育正常的徐州142的天然突变体，除种子无 毛外，fl突变体在表型上与野生型（wild type，WT）没有区别。因此本论 文主要以徐州142无绒无絮（无纤维）突变体（fl）与徐州142野生型近 等基因系为材料，利用稳定可靠、重复性好、覆盖面广、多态性检出率高 的AFLP分子标记技术，寻找筛选与棉花纤维发生相关的AFLP标记。主 要结果如下： 1．棉花基因组DNA提取技术的改进 由于棉花富含多糖和酚类物质，因而很难得到高质量的基因组 DNA。而AFLP分子标记技术成功的关键是以高质量的DNA为模板。实 验中通过改进棉花基因组DNA提取技术，采用在提取缓冲液中加入PVP_(40) 和β-巯基乙醇；样品加入提取缓冲液后快速振荡混匀；尽量减少沉淀时 间；挑出DNA沉淀和溶解离心去除杂质等措施，获得了高质量的棉花基 因组DNA。 2．近等基因系间的AFLP分析 利用AFLP试剂盒提供的全部引物组合检测徐州142无绒无絮（无纤 维）突变系（fl）和徐州142野生型（WT）近等基因系间的多态性，64对 引物组合共扩增出6360条清晰稳定的带纹，除引物对E-AGG、M-CTA在 该近等基因系间产生一条编号为CF_1差异带外，其余引物组合均未发现稳 定的多态性。由于该片段出现在无绒无絮和有绒有絮近等基因系间，推测 它可能与纤维发生相关。 3．CF_1标记的验证 为了验证CF_1与棉花纤维发生相关，在徐州142无绒无絮（无纤维） 突变系与纤维发育正常的渝棉一号的杂交后代F_2分离群体56个单株中， 选取有纤维的23个单株、无纤维的2个单株，共25个单株进行验证。有 棉市仔色发在的仆r分手标记 纤维的23株都有CF；标记，无绒无絮的两个单株无CF；标记。说明CF；标 记可能是与纤维有无相关的分子标记。 鉴于巳分离群体中无绒无絮单株们少，于是用巳分离群体继续进行 验证。对分别来自ZI个FZ：。家系的21个有纤维单株和来自7个Fz：。家系 的17个无纤维单株进行AFLP分析。17个无纤维单株均无CF；标记，而 21个有纤维单株都具有CF；标记。说明CF；标记与有纤维呈共分岛，是与 棉纤维发生相关的分子标记。 选用纤维发育正常的渝棉一号、徐州142、9mN34、TS 86和泅棉3 号5个陆地棚品种（系）进行ll，验证。以上品种都具有CF；标记，在 一定程度上进一步说明q与棉纤维的发生相关。 4．Cb和CFl片段的回收、克隆和序列分析 从银染的聚丙烯疏胺凝胶上回收特征片段（CF；）和紧邻的共有片段 （Cb）。重组质粒经 PCR和酶切分析鉴定，回收片段成功地克隆到 PUCm．T VeCtor上。 在 advanced BLASTh中查找核酸序列的相似性，发现特征片段与拟 南芥染色体上的一段序列、烟草叶绿体基因组的一段序列以及几个人类的 克隆序列有一定程度的相似性。同时在 adsanced BLASTh中根据 6种开放 阅读框查找其编码氨基酸序列的相似性，发现与酚羟化酶 a－亚基巾henol hydroxylase lpha subunit）、外表皮蛋白 C（outer su巾比 protein C） NADH脱氢酌亚基 1（NADH dehydrogenase subumt）、NADH－CoQ氧 化还原酶（N讪H叱biquinone oxidoreductase）、2－氧代·铁氧还蛋白－氧化 o原酶（2．oxoacid ferredoxin oxidorcduct）以及假拟 14．SKD 蛋白 （hypothetical 14．SKD protein）等有一定的相似性（High score分别为： 61、68、51、46、60． 44） 对Cb和CF；的核昔酸序列进行比较，两序列除有一个碱基的不同外， Cb在 197位后面比 CF；多 3个碱基（GCT），其余的序列都相同。推测 Cb和CF；可能是同一个基因家族的成员或者是A、D两个亚基因组上相对 应的片段。