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小金海棠遗传多样性及其Apf1基因的克隆、序列分析和遗传转化研究

周志钦  
【摘要】: 苹果属(Malus Miller)系蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloidae)植物。全属植物世界公认的有30-35种,主要分布于亚洲、欧洲和北美洲。中国至少有23种,如果加上近年发表的8个新种则种数达31个,主要分布在除海南省以外的全国29个省、市和自治区。其中分布种类占前3位的省分别是四川、云南、贵州和陕西,拥有种的数目分别为24种、17种和15种。分布最广的种是湖北海棠,达17个省、市和自治区。其次是三叶海棠,分布于15个省份。在我国苹果属植物不同种类分布的海拔范围差异达4000米以上,它们能生长在各种不同类型的土壤上,甚至沙漠、盐碱地到悬崖峭壁上都能生长。 我国的苹果资源研究在过去的几十年中,对苹果属植物的种类、数量、分布、形态学、系统学、细胞学、生殖生物学和抗逆境生物学特性等众多方面开展了广泛、系统和细致的研究,取得了许多重要的成果,但也存在明显的不足。首先,在研究的方向上基础研究和应用研究明显脱节,并且缺乏研究重点。对于像小金海棠一类的少数珍贵苹果基因资源缺乏深入、系统的研究。其次,资源研究的技术和手段落后,传统的田间保存技术由于没有专项经费,因病虫害等因素的影响,现保存资源的损失与日俱增,许多珍贵基因资源得而复失。利用现代生物技术的各种先进手段开展对苹果资源的保存、有用基因的鉴定和利用等方面的研究几乎是空白。第三,种的遗传多样性的研究是现代资源研究的重要课题,因为遗传多样性是资源的保存和利用研究的基础,而在这方面我国也几乎没有研究报道。分布在岷江上游和大渡河中上游流域之间,称为岷江一大渡河带的小金海棠(Malus Xiac Jinensis Cheng et Jiang)是世界苹果属植物分类中第一个由中国人命名发表的新种,是川西高原地区特有种。现有的研究表明,小金海棠不仅具有耐盐、耐旱、耐热、耐寒等多种抗逆境特性,对潜隐病毒也有较强的抗性。同时还具有高度的无融合生殖特性,与苹果品种嫁接亲和性好,嫁接树具有矮化、提早结果、果实品质好等优良性状。小金海棠作苹果砧木其综合性状优于M_7,是很有希望的苹果半矮化砧木。但目前有关小金海棠众多抗逆特性的分子基础,种群的遗传结构和遗传多样性等问题都没有研究报道,从而极大地限制了资源的开发和利用。因此,本论文选择小金海棠为研究材料,利用现代分子生物学技术,计划将研究的重点放在小金海棠种的遗传基础、与 抗逆性相关基因的分离克隆和通过转基因技术对克隆的基因进行功能验证方面。期望通 过本论文的研究能为利用现代生物学技术研究和开发利用我国宝贵的苹果基因资源探 索新的研究思路。 通过使用RAPD分子标记技术,PCR基因克隆技术、基因枪遗传转化技术和Treecon、 Areqwh、C一、DNAstar及 ntheh等计算机分析软件,本论文开展了小金海棠” 种的遗传基础、不同群体的遗传结构和遗传多样性分析:小金海棠铁结合蛋白基因的克 隆、序列同源性比较、基因结构分析和蛋白质特性、结构预测:小金海棠铁结合蛋白基 因植物表达载体的构建和对小麦的遗传转化等一系列研究,得到了预期的研究结果。现 将主要研究内容和结果总结如下: 1、小金海棠种的遗传基础用RAPD技术建立了小金海棠2个自然分布区的3个群 体内任意选取的 30株树门 株/每群体)及其相应的子代实生苗共 6个群体,60个样本 植株的分子标记。用T’REECON计算机软件和I{APD标记建立了全部60个样本植株间 的遗传关系。IUWD分子标记显示,具有高度无融合生殖特性的小金海棠在其现有自然 分布的群体和相应的实生苗后代中均存在不同基因型的个体。但无论是在现有分布群 体,还是在其相应的实生苗群体中,这种变异类型都不足1%。从遗传关系分析结果看, 在相距50公里的不同分布区的小金海棠群体间,己显示出有遗传分化的迹象。这一结 果与在小金海棠耐盐性实验中经常观察到的形态表现差异是相吻合的,也符合小金海棠 的生殖特性。 二、小金海棠群体的遗传结构 通过对15个随机引物在小金海棠6个群体的60个样 本植株中产生的 sl条 RAPD带的统计,计算了 RAPD多态性带的数目、汪小全等O) 群体的多态性位点百分率和 Net (197)的群体杂合性。结果是 15个筛选出的引物在全 部分析个体中产生了58条多态性带,平均每引物3.8条。现有分布三个群体平均多态性 带的数目不足1,二条,其相应的子代实生苗群体平均也只有1.8条。其中平均多态性带的 数目最低的群体仅有 0.7条,最高的群体也只有 25条。汪小全等O)群体的多态 性位点百分率在现有群体及其相应的实生苗群体平均分别为ZI.3%和33.3%。Net (197) 的群体杂合性(全部位点)在现存群体及其相应的实生苗群体平均分别为0.103和0.154。 这一结果显示,小金海棠群体内部遗传结构较单一,遗传多样性低。虽然群体内不同的 个体间存在一定的遗传差异,但这种差异实在一个很低的水平上。对小金海棠不同群体 的遗传多样性及其在世代间的变化分析结果,进一步说明小金海棠同一世代不同分布区 2


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