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AGP小亚基反义基因导入魔芋研究

李贞霞  
【摘要】: 魔芋是单子叶植物纲(Monocotyledoeae)天南星科(Araceae)魔芋属(Amorphophallus Blume)的多年生草本植物,原产于印度和斯里兰卡,在我国有2000多年的栽培历史,是传统的食品和草药,目前在现代食品、医药和化工等方面也得到广泛的开发和利用。魔芋以其高产出、高利润的优势,成为我国中西部山区的重要经济作物,发挥了很好的扶贫致富和富民强县的作用,并形成集科、农、工、商、贸于一体的产业。然而,魔芋种植业现在却成为魔芋产业发展的瓶颈,主要存在品种退化、良种缺乏和更新缓慢等问题。选育高品位的新品种是生产上急需的和一个长期的课题。品质改良的主要目标在于增加葡甘露聚糖含量和减少淀粉的积累。葡甘露聚糖含量越高和淀粉含量越低的品种,品位越高,加工出来的精粉产量越高和质量越好。 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)是植物淀粉生物合成的关键酶。它催化1-P-G和ATP生成的ADP—葡萄糖(ADPG)。后者将作为淀粉合成酶的底物直接参与直链淀粉和支链淀粉的合成。在植物中,该酶是由二个大亚基(AGPL)和二个小亚基(AGPS)组成的异源四聚体。目前,该酶及其基因已经从玉米、小麦、菠菜等多种植物中得到分离纯化和研究。在不同物种间,小亚基高度保守,而大亚基相对变幅较大;小亚基是酶的活性中心,而大亚基则主要起调节作用。1993年美国Mosounto公司将来自大肠杆菌的AGP基因导入马铃薯,其块茎的淀粉和干物质含量平均提高24%;相反,若导入该酶的反义基因,则淀粉含量下降到只有对照的2%。因此通过对该酶的遗传操作,可以达到显著增加或减少植物体内淀粉含量的目的。 本论文属国家自然科学基金项目“魔芋淀粉合成的反义抑制研究”的部分内容。主要是将通过RT-PCR方法钓取的白魔芋AGP小亚基基因(AGPS1)构建成反义基因表达载体,以白魔芋愈伤组织为试材,分别探讨农杆菌转化和基因枪法转化的条件,获得整合有AGPS1反义基因的转基因植株,并对获得的转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测,为今后采用转基因手段进行魔芋育种和品质改良奠定基础。现将主要研究内容和结果总结如下: 1、AGPS1反义基因表达载体的构建 将位于质粒pCR—AGPS1上的AGPS1片段经SacI/XbaI酶切后,替代质粒p35S-GUS载体中的GUS基因,即构建成带有AGPS1反义基因表达盒的载体p35S—AGPS1,其中AGPS1基因的3’端位于CaMV 35S启动的下游,5’端位于Nos终止子的上游。EcoRI/HindIII酶切后回收该反义基因表达盒,插入到pBINPLUS双元载体的对应位点,获得了大小为13.93kb的AGPS1反义基因双元表达载体pBIN—AGPS1。该质粒含Kan抗性筛选基因,导入农杆菌后可用于农杆菌介导的魔芋遗传转化。 将质粒PGS 和 PBluescript 11 KS+(pBSKS-)经EcoRI/Sacl酶切后分另回收小片段和 大片段,并对回收的片段进行连接,获得含有除草剂抗性基因Pat的质粒P35S干AT。对质 粒P35S-PAT和含有AGPSI反义基因表达盒的P35S-AGPSI进行ECORI/HIOdlll酶切,分别 回收大片段、小片段后连接,获得大小为5.slkb的AGPSI反义基因表达载体pPAT{。 该质粒DNA直接用于基因枪法微弹介导的转化。 2、农杆菌介导的魔芋遗传转化体的建立 取正在生长的魔芋愈伤组织,切成0.5见方大小,分接接种于含0、25、SO、75、100、 125、150、175、200mg几卡那霉素“an)的MS培养基,观察Kan对魔芋愈伤组织分化的 影响。将魔芋愈伤组织块接种于含0、100、200、300、400、500、600。g/L竣芋青霉素(Carb) 的MS培养基中,观察不同的抑制剂浓度对魔芋愈伤组织生长和分化的影响,并探讨预培养 时间对转化的影响等。结果表明,适于魔芋愈伤组织遗传转化的筛选压浓度为75mg几的卡 那霉素;当筛选压Kan浓度大于100mg/L时,魔芋愈伤组织生长缓慢,逐渐死亡。Carb对 魔芋芽分化的影响不显著,随着浓度的增大,Carb对厦芋芽分化的抑制作用也增强,但这 种抑制效果在实验浓度范围内与对照的差异不显著.较为适宜的抑菌浓度为Carb30UL。 魔芋的预培养时间与甘蓝、油菜的相似,均以 2天为宜。因此,较适宜魔芋的农杆菌转化 条件为:魔芋愈伤组织预培养2天,直接接种农杆菌菌液,共培养2天,延迟筛选6-7天 和在含有75mg/二的 Kan和300mg/L Carb的芽分化培养基上筛选等。 3、基因枪法微弹介导的魔芋遗传转化体系的建立 将魔芋愈伤组织接种于含有不同浓度除草剂Basta(0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、 1.50、1.75、2.00mg/L)的MS培养基上,观察除草剂对魔芋愈伤组织芽分化的影响。结果 表明,ZmyL的B肪t。就足以使魔芋愈伤组织致死,B%t刊。吧儿就足以抑制正常的芽再生。 实际操作中,为了得到较多的转化子,早期选用M/L Basta作为选择压,而后期的筛选 使用Zing几较高浓度的Basta,以确保获得真正的转化子。 同时,对基因枪的轰击参数氦气压力和轰击距离等进行了探讨。魔芋具有分化潜能的 细胞位于愈伤表面,较低的轰击压力和适当的轰击距离,将有助于子弹击中该细胞层,提 高转化的频率。实验表明,氦气压力/轰击距离以1100Psi伯 最适。在轰击前4h和轰击


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