棉花ADP核糖基化因子基因GhARF的克隆

【摘要】： 分离植物花粉发育相关基因，不仅有助于探明植物花粉发育的分子模式，还可以更好地推动植物雄性不育基因工程和杂种优势利用的发展。 棉花洞A雄性核不育系是1972年从洞庭一号棉花原种圃中发现的突变体，不育度高且稳定，可育与不育花粉在单核期以前发育同步，是研究棉花花药与花粉发育相关基因的理想材料。GHA27是棉花洞A不育株和可育株花药发育的cDNA-AFLP差别显示回收的差异片段，此片段与大豆、拟南芥等植物的ADP-ribosylation factor(ARF)基因相似。本研究利用差异片段GHA27为探针筛选棉花花药cDNA文库，获得了ARF基因的全长cDNA序列，并进一步作了序列和表达分析。实验主要得到以下结果： 1．棉花ARF基因的克隆 选取棉花洞A雄性不育株和可育株花药cDNA-AFLP差别显示的差异片段GHA27，用地高辛标记作为探针，筛选棉花洞A花药的cDNA文库，克隆得到了棉花ARF基因的cDNA全长序列，将其命名为GhARF(Gossypium hirsutum ADP-ribosylation factor)。 2．棉花ARF基因的序列分析 核苷酸序列分析表明，GhARF的全长为828bp，其中含有一个从131bp到676bp间的546bp构成的一个完整开放阅读框，它编码181个氨基酸、分子量为20.7kD的蛋白质。在5’端有130bp的非编码区，3’端非编码区长152bp，内含PolyA加尾信号AATTAA及PolyA尾。 3．棉花ARF基因的同源性分析 应用NCBI进行DNA序列的相似性分析，结果表明：棉花ARF基因与其它植物、动物和酵母的ARF基因具有较高的同源性。棉花ARF基因编码的氨基酸序列与拟南芥，小麦、马铃薯、牛的同源性分别达到99％(179/180)、98％(177／180)。96％(174／180) 杨花肠P核符吞fi曰手谷回伽皿的夭险 和 92％（168ill）。 4．ARF基因氨基酸序列的保守域 氨基酸序列分析表明，ARF’基因编码的氨基酸序列中具有保守的GTh结合区域： P（GLDAAGKT）、G（NKQDL）以及G’（DVGGO）。 5．棉花ARI；’基因的表达分析 用地高辛将棉花ARF基因标记为探针，与棉花洞A的不育株花药、司有株花药、 可育花粉粒、叶片、花冠、胚根和胚珠的总RNA进行斑点杂交。结果表明，ARF基因 在棉花中的表达具有组织特异性：在可育花药、不育花药、可育花粉粒和花冠中表达， 而在叶片、胚根和胚珠中不表达。 6．Southern blot分析 用 Bgl 11、Kpn、Hindlll EcoRV、EcoR五种限铝性内切酶分另酶切棉花 洞A的基因组DNA，用地高辛标记的ARF作为探针与之进行Southern杂交c杂交结果 显示，ARP基因在陆地棉基因组中可能至少有两个拷贝。