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棉花ADP核糖基化因子基因GhARF的克隆

王文锋  
【摘要】: 分离植物花粉发育相关基因,不仅有助于探明植物花粉发育的分子模式,还可以更好地推动植物雄性不育基因工程和杂种优势利用的发展。 棉花洞A雄性核不育系是1972年从洞庭一号棉花原种圃中发现的突变体,不育度高且稳定,可育与不育花粉在单核期以前发育同步,是研究棉花花药与花粉发育相关基因的理想材料。GHA27是棉花洞A不育株和可育株花药发育的cDNA-AFLP差别显示回收的差异片段,此片段与大豆、拟南芥等植物的ADP-ribosylation factor(ARF)基因相似。本研究利用差异片段GHA27为探针筛选棉花花药cDNA文库,获得了ARF基因的全长cDNA序列,并进一步作了序列和表达分析。实验主要得到以下结果: 1.棉花ARF基因的克隆 选取棉花洞A雄性不育株和可育株花药cDNA-AFLP差别显示的差异片段GHA27,用地高辛标记作为探针,筛选棉花洞A花药的cDNA文库,克隆得到了棉花ARF基因的cDNA全长序列,将其命名为GhARF(Gossypium hirsutum ADP-ribosylation factor)。 2.棉花ARF基因的序列分析 核苷酸序列分析表明,GhARF的全长为828bp,其中含有一个从131bp到676bp间的546bp构成的一个完整开放阅读框,它编码181个氨基酸、分子量为20.7kD的蛋白质。在5’端有130bp的非编码区,3’端非编码区长152bp,内含PolyA加尾信号AATTAA及PolyA尾。 3.棉花ARF基因的同源性分析 应用NCBI进行DNA序列的相似性分析,结果表明:棉花ARF基因与其它植物、动物和酵母的ARF基因具有较高的同源性。棉花ARF基因编码的氨基酸序列与拟南芥,小麦、马铃薯、牛的同源性分别达到99%(179/180)、98%(177/180)。96%(174/180) 杨花肠P核符吞fi曰手谷回伽皿的夭险 和 92%(168ill)。 4.ARF基因氨基酸序列的保守域 氨基酸序列分析表明,ARF’基因编码的氨基酸序列中具有保守的GTh结合区域: P(GLDAAGKT)、G(NKQDL)以及G’(DVGGO)。 5.棉花ARI;’基因的表达分析 用地高辛将棉花ARF基因标记为探针,与棉花洞A的不育株花药、司有株花药、 可育花粉粒、叶片、花冠、胚根和胚珠的总RNA进行斑点杂交。结果表明,ARF基因 在棉花中的表达具有组织特异性:在可育花药、不育花药、可育花粉粒和花冠中表达, 而在叶片、胚根和胚珠中不表达。 6.Southern blot分析 用 Bgl 11、Kpn、Hindlll EcoRV、EcoR五种限铝性内切酶分另酶切棉花 洞A的基因组DNA,用地高辛标记的ARF作为探针与之进行Southern杂交c杂交结果 显示,ARP基因在陆地棉基因组中可能至少有两个拷贝。


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