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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因及几丁质酶基因的克隆与特征分析

钟万芳  
【摘要】: 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是当前应用最广、最有效的微生物杀虫剂。其突出特征是在形成芽孢的过程中,能形成具有杀虫活性的伴胞晶体。伴孢晶体是Bt杀虫活性的主要来源,它由一种或几种晶体蛋白组成,具有高度特异的杀虫活性,这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或δ-内毒素(δ-endotoxins)。ICPs的专一性很强,通常一种毒素只能杀死某一目标昆虫,对益虫及脊椎动物无毒,是一种安全有效的杀虫蛋白。到目前为止,已有二百多种ICP基因被克隆。但是随着Bt应用的不断扩大,Bt-ICPs基因均在不同程度上引发了昆虫的抗性。所以,寻找新的高毒力菌株及基因以延缓昆虫对Bt的抗性是解决昆虫抗性问题的有效途径。 几丁质又叫甲壳素、壳多糖、聚乙酰氨基葡糖,是昆虫外壳及中肠围食膜的主要结构成分。几丁质酶可将几丁质分解成N-乙酰氨基葡萄糖;研究表明,几丁质酶能增强Bt的杀虫效果,有利于克服或延缓昆虫对Bt的抗性。 基于以上考虑,本论文设计了两对引物,应用PCR技术分别从Bt sotto质粒DNA和Bt israelensis基因组DNA中扩增得到杀虫晶体蛋白cry1Aa13基因和几丁质酶ichi基因,并进行了序列分析和功能预测。主要研究结果如下: 1.建立了苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取方法。该方法可有效去除染色体DNA及RNA,省略了苯酚和氯仿抽提过程,不用担心痕量酚对质粒DNA质量的影响。 2.根据cry1A基因保守序列设计引物,利用PCR技术扩增了杀虫晶体蛋白基因,该基因已在GenBank中登录,登录号为AF510713,目前已被Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Aa13。 3.对cry1Aa13进行了生物信息学分析,发现该基因含有一个由3543bp组成的开放阅读框,编码1180个氨基酸,分子量约为133.50kDa。氨基酸序列与cry1Aa类基因高度同源,达95% 苏云金井他杆菌杀虫品体葫臼基因及几丁匝荫基因的克隆与特征分析 以上;其编码区含有三个保守结构域,即结构域1、结构域11和结构域m。 4-根据儿丁质酶基因保守序列设计引物,利用PCR技术扩增了几丁质酶ci基因,该基因已在 GcnBank中登录,登录号为AF526379。 5.对 ichi进行了生物信息学分析,发现该基因序列全长为 2570hp,包括启动于、N码区和终止 子序列,是一个完整的基因。其中编码区由一个m价加的开放阅读框(ORF)组成,编码 688 个氢基酸,推测分子量为 75.79 kDa,等电点 pled.o。Itlll由分泌信号肽(46AA)、催化区 (105AA)、粘蛋白皿型同源区(74AA)和几丁质结合区(4()A)4个结构域组成。


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