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野桑蚕α-淀粉酶基因的分段克隆、序列分析及其分子系统学研究

廖芳  
【摘要】: 家蚕是重要的经济昆虫,也是分子遗传学研究中重要的模式生物。蚕学研究的深入促进了家蚕近缘种—野桑蚕的研究。野桑蚕作为丰富的野生蚕业资源,是可开发利用的宝贵基因库,用于增加家蚕的遗传多样性和进行品种复壮,同时也是研究家蚕起源分化的重要材料。迄今已对野桑蚕进行了广泛的生物学上的研究、染色体结构及变异研究、DNA多态性研究、家蚕育种上的应用研究以及作为桑园害虫防治上的研究。α-淀粉酶是家蚕生物学上非常重要的功能酶类,已有大量的研究报道,但迄今还没有野桑蚕α-淀粉酶及基因的相关报道。本文对野桑蚕α-淀粉酶基因进行全序列测定与分析,并作了基于Intron Ⅰ的家蚕和野桑蚕分子系统学初步研究。 1.重庆野桑蚕α-淀粉酶基因全序列的测定 根据家蚕α-淀粉酶全基因序列设计了的7对引物,对野桑蚕α-淀粉酶基因进行了分段扩增,并逐一克隆测序和序列拼接,得到8093bp的野桑蚕α-淀粉酶基因全序列。 野桑蚕α-淀粉酶基因全序列的AT%为51.61%,包含5个外显子和4个内含子,外显子的AT%平均值为49.35%,内含子的AT%平均值为63.23%。 在Intron Ⅱ中有一个完整的non-LTR retrotransposon,其内编码一个reverse transcriptase;Intron Ⅱ还有一段序列与另外一种反转座子的部分序列高度同源。 2.家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因序列比较分析 家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因具有相似的基因结构,都包含5个exon和4个intron,各内含子、外显子长度在家蚕和野桑蚕间较类似,外显子和内含子AT%的平均值差异不大。家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因核苷酸序列相似性为90%,推定氨基酸序列相似性为98%。 家蚕、野桑蚕α-淀粉酶基因Intron Ⅱ中的(野桑蚕)non-LTR retrotransposon之间序列长度相等,相似性为98%,其内编码reverse transcriptase的基因,序列长度相等,核苷酸序列和氨基酸序列相似性达98%。 野桑蚕相对于家蚕来说,在α-淀粉酶基因外显子区域发生了13次转换、4次颠换、12bp插入,在内含子区域发生了362次转换、343次颠换、94bp插入和56bp缺失,全基因(包括UTR)共发生 MMrttoopMI-MgZX$ffatt 了380次转换、350颠换、113hp插人和57hp缺失。 家蚕、野桑蚕a-淀粉酶基因密码子碱基组成统计结果表明:H者密码子3个位点的碱基组成差 异非常小。 3.五种昆虫的Q-淀粉酶基因序列的比较分析 野桑蚕 a-淀粉酶基因核苦酸序列与家蚕、草地贪夜蛾(Spodotera户u归rdaX玉米螟(Ostrinia nubilalis on 25)和果蝇(Dnsophila subobsc。)相似性分别为 90o、12%、12O、50,推定氨基酸 序列相似性分别为98%、80%、78%、58%,表明:野桑蚕与家蚕的亲缘关系最近,果蝇与野桑蚕的 亲缘关系相对较远。 4.家蚕、野桑蚕a-淀粉酶基因密码子碱基组成统计比较 对密码子进行了碱基组成的统计比较,结果表明:家蚕与野桑蚕间密码子三个位点的碱基组成非 常相似。密码子位1都表现出明显的瞟吟碱基偏好性(家蚕59.88%,野桑蚕59.90%);密码子位2亦 表现较弱的瞟吟偏好性(家蚕55.07%,野桑蚕54.64%);密码子位3有强烈的啼陡偏好性,家蚕和 野桑蚕的CT%分别为67.77%和67.17O,其中家蚕的Co为35.79o,野桑蚕的C%为35.59%,特别 占优势。位点2的ATO/较高,位点1、3差异极小。 5.根据 Intron序列进行了初步的分于系统学研究 基于六种家蚕品种C108、大造、白夏B、BH863、赤塾和重庆野桑蚕的 Intron的序列,以草地 贪夜蛾(坯m加teraMiperda)和果蝇(Dnaophila subobscura)为外群,采用 UPGMA法构建的分子 系统树表明:家蚕与野桑蚕之间有非常近的亲缘关系,家蚕中BH863似乎与野桑蚕之间有最近的亲 缘关系,这一初步研究结果还有待进一步证实。


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