野桑蚕α-淀粉酶基因的分段克隆、序列分析及其分子系统学研究

【摘要】： 家蚕是重要的经济昆虫，也是分子遗传学研究中重要的模式生物。蚕学研究的深入促进了家蚕近缘种—野桑蚕的研究。野桑蚕作为丰富的野生蚕业资源，是可开发利用的宝贵基因库，用于增加家蚕的遗传多样性和进行品种复壮，同时也是研究家蚕起源分化的重要材料。迄今已对野桑蚕进行了广泛的生物学上的研究、染色体结构及变异研究、DNA多态性研究、家蚕育种上的应用研究以及作为桑园害虫防治上的研究。α-淀粉酶是家蚕生物学上非常重要的功能酶类，已有大量的研究报道，但迄今还没有野桑蚕α-淀粉酶及基因的相关报道。本文对野桑蚕α-淀粉酶基因进行全序列测定与分析，并作了基于Intron Ⅰ的家蚕和野桑蚕分子系统学初步研究。 1．重庆野桑蚕α-淀粉酶基因全序列的测定 根据家蚕α-淀粉酶全基因序列设计了的7对引物，对野桑蚕α-淀粉酶基因进行了分段扩增，并逐一克隆测序和序列拼接，得到8093bp的野桑蚕α-淀粉酶基因全序列。 野桑蚕α-淀粉酶基因全序列的AT％为51.61％，包含5个外显子和4个内含子，外显子的AT％平均值为49.35％，内含子的AT％平均值为63.23％。 在Intron Ⅱ中有一个完整的non-LTR retrotransposon，其内编码一个reverse transcriptase；Intron Ⅱ还有一段序列与另外一种反转座子的部分序列高度同源。 2．家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因序列比较分析 家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因具有相似的基因结构，都包含5个exon和4个intron，各内含子、外显子长度在家蚕和野桑蚕间较类似，外显子和内含子AT％的平均值差异不大。家蚕和野桑蚕α-淀粉酶基因核苷酸序列相似性为90％，推定氨基酸序列相似性为98％。 家蚕、野桑蚕α-淀粉酶基因Intron Ⅱ中的(野桑蚕)non-LTR retrotransposon之间序列长度相等，相似性为98％，其内编码reverse transcriptase的基因，序列长度相等，核苷酸序列和氨基酸序列相似性达98％。 野桑蚕相对于家蚕来说，在α-淀粉酶基因外显子区域发生了13次转换、4次颠换、12bp插入，在内含子区域发生了362次转换、343次颠换、94bp插入和56bp缺失，全基因(包括UTR)共发生 MMrttoopMI－MgZX＄ffatt 了380次转换、350颠换、113hp插人和57hp缺失。 家蚕、野桑蚕a－淀粉酶基因密码子碱基组成统计结果表明：H者密码子3个位点的碱基组成差 异非常小。 3．五种昆虫的Q－淀粉酶基因序列的比较分析 野桑蚕 a－淀粉酶基因核苦酸序列与家蚕、草地贪夜蛾（Spodotera户u归rdaX玉米螟（Ostrinia nubilalis on 25）和果蝇（Dnsophila subobsc。）相似性分别为 90o、12％、12O、50，推定氨基酸 序列相似性分别为98％、80％、78％、58％，表明：野桑蚕与家蚕的亲缘关系最近，果蝇与野桑蚕的 亲缘关系相对较远。 4．家蚕、野桑蚕a－淀粉酶基因密码子碱基组成统计比较 对密码子进行了碱基组成的统计比较，结果表明：家蚕与野桑蚕间密码子三个位点的碱基组成非 常相似。密码子位1都表现出明显的瞟吟碱基偏好性（家蚕59．88％，野桑蚕59．90％）；密码子位2亦 表现较弱的瞟吟偏好性（家蚕55．07％，野桑蚕54．64％）；密码子位3有强烈的啼陡偏好性，家蚕和 野桑蚕的CT％分别为67．77％和67．17O，其中家蚕的Co为35．79o，野桑蚕的C％为35．59％，特别 占优势。位点2的ATO／较高，位点1、3差异极小。 5．根据 Intron序列进行了初步的分于系统学研究 基于六种家蚕品种C108、大造、白夏B、BH863、赤塾和重庆野桑蚕的 Intron的序列，以草地 贪夜蛾（坯m加teraMiperda）和果蝇（Dnaophila subobscura）为外群，采用 UPGMA法构建的分子 系统树表明：家蚕与野桑蚕之间有非常近的亲缘关系，家蚕中BH863似乎与野桑蚕之间有最近的亲 缘关系，这一初步研究结果还有待进一步证实。