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家蚕AFLP标记连锁图谱的构建与分析

陈大霞  
【摘要】: 家蚕是重要的农业经济昆虫,也是生物学研究的极好材料。家蚕分子连锁图谱的构建可以极大的推动家蚕分子生物学的研究,是家蚕遗传学基础理论研究与实际应用之间的重要桥梁。构建高密度的分子连锁图谱既可以对控制产量及品质等的数量基因和抗病基因进行分析、定位,也可以通过分子标记进行辅助选择,以提高育种效率,而且我们还可以借助分子连锁图提供的指导进行基因克隆和外源基因导入等方面的研究。为此,本研究室建立了RAPD、SADF、AFLP等分子标记连锁图谱的构建方法并绘制了几种标记的连锁图谱。本研究是在已有研究的基础上,利用AFLP标记技术,绘制高密度的分子标记连锁图谱,为进一步的QTL定位和分子标记辅助选择(MAS)奠定基础。 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,简称AFLP)标记技术是一种新型的DNA分子标记技术,兼具RAPD标记多态性检测率高和RFLP标记稳定性好的特点,目前已广泛应用于多种生物连锁图谱的构建和数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)定位,具有广泛的应用前景,近几年开始运用于家蚕。本研究运用AFLP-银染标记技术构建了一张较高密度的家蚕分子连锁图并进行了分析。主要结果如下: 1 AFLP-银染检测技术的改进 (1)参照常规的银染检测技术,凝胶撕裂现象时有发生,胶板处理繁锁,费时费力,且对操作技术要求极高。针对以上问题,本研究通过多次各种试验,对AFLP-银染检测技术进行了一定的改进:采用短玻璃涂布剥离硅烷和用无水乙醇代替95%乙醇进行胶板的前期处理,可以有效的防止凝胶撕裂现象的发生。并就如何有效的克服气泡的产生进行了初步探索。 (2)本文通过各种温度试验对AFLP银染过程中温度的影响进行了分析。结果显示:在25℃左右进行胶板的前期处理和凝胶的制备为最佳温度。 2 家蚕AFLP标记的多态性分析 数据统计结果表明:66对引物共扩增出8710条可区分的DNA带型,每组引物平均扩增132条带。其中有1559条带呈多态性,占所观察到的总扩增带的17.9%,平均每组引物产生23.6条多态性带。所有多态性位点经X~2检测后,有692个位点符合3∶1的比例,占总多态性位点的44.39%。396个位点符合1∶1的分离比例,占总多态性的25.4%。其余位点为无效位点。本实验中可检测的片段大小在100-1000bp之间。 3 家蚕AFLP标记在杂交F2代的遗传模式分析 本文对AFLP标记在杂交F2代的遗传模式进行了探讨,发现AFLP分子标记技术不仅具备其它分子标记技术所具有的特点,而且带纹丰富,灵敏度高。将本实验中得到的692个AFLP标记经MAPMAKER软件检测无共显性标记,表明AFLP确为显隐性遗传模式,其杂交F_2代的遗传模式见 表3。本试验中,家蚕AFLP标记的偏分离比例为30.2%,属于正常范围。 4家蚕AFLP标记连锁图谱的构建 (l 692个有效位点中的550个构成了a、b两亚群,占有效位点的79.48%,占总多态性位点的 35工8%,还有142个位点不连锁,未进入连锁图中。 (2)将 302个来自母本湘晖,390个来自父本 872的标记各自分为 2!个和 28个连锁群。湘晖的 入个连锁群,命名为 a亚群,872的 28个连锁群,命名为 b亚群。在 a亚群中有 233个位点连锁, 69个位点不连锁。在 b亚群中有 317个位点连锁,非连锁的位点 73个。 ①a亚群中各连锁群上标记数目变化范围在443个之间,连锁群的长度变化在22.3 cM-424.3cM 之间,标记的平均图距变化在3.98CM,17.43CM之间。位点间的平均距离为8.slCM。平均图距小于 10CM的连锁群有]3个,大于 10CM d\于 20CM的连锁群有 8个。ZI个连锁群上位点平均数为门.1个, 连锁群的平均长度为89CM。b亚群中各连锁群上标记数目变化范围在3-35个之间,连锁群的长度变 化在2.4CM-366.SCM之间,标记的平均图距变化在0.SCM-26.96。M之间,位点间的平均距离为 9二6CM。平均图距小于10CM的连锁群有18个,大于10CM ’J’于20CM的连锁群有10个。28个连锁 群上位点平均数为 11.引个,连锁群的平均长度为 95.6CM。 (4}a亚群中对个连锁群的总长度为 1868.IcM,b亚群中 28个连锁群的总长为 2677.50cM,a、 b两亚群平均总长为2272.scM (5)分析表明,连锁群的长度与标记数目呈正相关,即当一个连锁群上的标记数目较多时,其长 度也相应地增长;同时标记数目中少部分有成簇的现象,估计是因为位点之间联系较紧密。 5不同群体的作图比较 本着连锁群数应接近家蚕的染色体数的原则,分别对gi、71、引群体在相同参数和不同参数的 情况下进行作图分析,结果表明:为使本来连锁的标记能进入连锁群,重组值的设定不能太小。也 就是说,若研究目的是为了QTL定位,群体的选择不能太小,证实了本实验以gi群体为作图材料 是优于刀、引群体的。


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