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家蚕几种组织的EST及基因表达特征分析

沈以红  
【摘要】: 本实验室选择家蚕12种不同组织器官和细胞,构建5′端非偏性cDNA文库,对每个文库大规模EST测序。本文在获得的大规模EST数据基础上进行数据分析、挖掘,以期发现家蚕的重要功能相关基因,并获取基因表达的组织差异和特异信息。这些基因的功能和表达信息获得,对家蚕有用基因资源的深度开发及鳞翅目害虫的有效控制有重要价值。 1 基于EST数据的基因表达谱聚类方法 本文采用基于大规模EST数据的基因表达谱聚类法,探讨在测序数据大量获得时从中提取有价值信息的数据分析方法。利用两两基因(contig)或样本(文库)的相关系数定义基因或样本间的距离,构建中高丰度表达基因和所有测序文库的进化树。从contig的进化树中获得具有一致表达特征的成组基因。文库进化树反映了构建文库的组织间的亲疏关系。 利用Audic和Cleaverie取得的一个新的适用于分析标签抽样数据显著性检验的成对状况比较法分析组织间差异表达基因,获得在两种组织间和同一组织不同时期基因表达显著不同的基因。 2 大规模EST特征 2.1 文库构建及初步分析 本实验室以家蚕品种“大造”为材料,选取五龄幼虫重要组织丝腺、中肠、脂肪体、体液、生殖腺和发育期胚胎共构建12个非偏性cDNA文库,5′端方向大规模测序,获得81625个合格的EST序列,Phrap软件拼接获得24678个非冗余序列(UniGene),其中包括11627个重叠群(contig),13051个独立EST(Singleton)。 同源分析共检索到7944个UniGene与GeneBank等数据库的数据同源,同源且有功能注释的已知基因有3899个UniGene(32605个EST);同源但没有功能注释的已知序列有4045个UniGene(16087个EST);新序列有16734个UniGene,(32933个EST)。本次测序共有60%的EST为未知功能序列。 2.2 基因表达谱聚类 对3064个contig(EST≥5)和12个文库分别聚类,构建树形图。Contig聚类结果,各文库中表达趋势一致的contig在树形图中构成相邻的一群,从中获取在本测序范围内文库(或组织)特异表达的contig以及组织间协同表达的contig,并作进一步研究。文库聚类结果,培养细胞、中肠和非受精卵与其它组织基因表达谱差异很大。脂肪体雌与雄、血液雌与雄、丝腺与卵巢表达谱很相似。丝腺与卵巢表达谱相似是一个有趣又值得探讨的现象。 2.3 所有文库中普遍表达基因分析 对所有测序组织中都有表达的UniGene分析,这部分有12个已知基因和7个已知序列。已知基因包括膜蛋白tetraspanin D107、翻译调控肿瘤蛋白同源物(TCTP)、热激相关蛋白、泛素融合蛋 西南农业大学博士学位论文 生.目里典.里奥.月.目里巨口口目目典目目里县口 白、鸟氨酸脱梭酶抗酶;、Y盒蛋白c卜妙。、核糖体蛋白、蛋白合成起始因子和翻译延长因子、 丝素轻链、丝·J·蛋白P25和30kD蛋白等蛋白基因,在维持家蚕正常生命活动中它们有重要作用。特 别是丝素轻链、丝…蛋白P25和30kD蛋白,该结果表明它们参与了家蚕重要的基础代谢过程。 2.4所有文库中极高表达基因分析 对所有侧序组织中极高表达基因分析,有64个UniGene(EST)100),代表巧个已知基因和7 个已知序列。已知基因按表达量高到低依次是贮藏蛋白30kD,核糖体蛋白,丝心蛋白丝素轻链前体, 丝氨酸蛋白酶,翻译控制肿瘤蛋白同源物(T叮P),跨膜蛋白(tetrasP8nin D107)、P25、贮藏蛋白 SPZ和SPI、热激蛋白、溶菌酶、成虫翅盘生长因子、泛素等基因。除丝氨酸蛋白酶基因是中肠特异 表达,贮藏蛋白和成虫翅盘生长因子基因主要在脂肪体表达外,其余基因在各个组织中均表达。这 些家蚕生理功能重要蛋白基因的高表达,显示五龄盛时期蛋白质旺盛合成的生产特性和为发育变态 作物质准备这一生理特点 3.家蚕脂肪体组织基因表达谱 3.1脂肪体特异表达基因 幼虫脂肪体特异表达基因包括已知基因23个,未知功能序列52个。其中贮藏蛋白、抗菌蛋白 和类IDGF基因居表达量前三位,显示脂肪体合成贮藏蛋白、抗菌蛋白及参与发育的盆要生理功能。 此外,保幼激素结合蛋白基因少量表达。检索silkBase数据库进一步确定其中三个未知功能序列 coatig是脂肪体特异表达. 蛹脂肪体特异表达基因包括7个己知基因(共5.52%),未知功能序列108个(94.5%).已知 基因有抗菌物hemofin、微管蛋白、表皮蛋白、转座酶、载脂蛋白基因低表达量表达。此外,特异表 达的未知功能序列有早期卵壳基因的非编码区及相关的重复序列以较高水平表达。 3.2雌雄差异表达基因 贮藏蛋白SPI和SPZ基因、与发育调控有关的蛋白基因、与能量代谢和卵形成有关的磷酸甘油 酸脱氢酶基因在雌表达均比雄高;而贮藏蛋白3OkD蛋白、蛋白代谢有关的酶基因和胰蛋白酶抑制剂 基因在雄表达高于雌,显示在mRNA合成阶段,就决定了性差别的特性,家蚕利用蛋白质方面雌雄可 能有差别。 3.3幼虫蛹差异表达基因 幼虫脂肪体内活跃进行多种物质代谢相关蛋白基因的表达,特别是贮藏蛋白和组织发育有关的 调控蛋白、蛋白酶抑制剂和抗菌肤等基因;蛹脂肪体主要表达热激蛋白、表皮蛋白、微管和微


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