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植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究

彭远义  
【摘要】: 植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶,它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能,因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中,其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景,但微生物天然菌株产酶水平较低,加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求,从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆,并利用分子生物学技术构建基因工程菌,或在分子水平上改造植酸酶基因,以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质,从而降低生产成本,提高其使用有效性,己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株,并进一步通过诱变选育提高其产量,对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析,在此基础上,构建植酸酶高产基因工程菌,从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下: 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌,从中挑选出透明圈较大的菌株32株,经分离纯化后分别进行摇瓶复筛,28℃、220r/min发酵5天后,在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活,结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高,达345U/mL发酵液;编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高,分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况,选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定,03214号菌为黑曲霉,编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株,通过紫外线诱变处理不同时间,经平板初筛和摇瓶复筛,获得一株产酶活性较高的突变株03214-3,酶活为373U/mL发酵液,比出发菌株提高了8%左右。以突变株03214-3为出发菌,经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间,最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3%,达422.3U/mL发酵液的突变菌株,编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代,分别测定各代菌株酶活,结果其酶活稳定在410~430U/mL发酵液之间,说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性,可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆 ,,画.‘,,妇..圈.翻‘通~ 以A,e啥1111”nigerN14为出发菌,采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA,经 紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右,表明这两种方法均适合提取黑曲霉 基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下,以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点,结合已报道植酸酶神州基因序列,自 行设计一对特异性引物(上游引物:5,月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口,;下游引物: 5,CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3,),采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶), 通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物,将其与 pMD18.T载体连接后,转化大肠杆菌Dll5Q,.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR 鉴定,确认该目的基因已得到成功克隆。 4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明,本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列 (GeneBank AcceSSIOn:AY4269”),夕句讨基因全长15仅无p,其中包含一段长102bp的内含子 序列,编码467个氨基酸,5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列 CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因 中G+仁含量达54.7%,密码子第三位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基 因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟,己心iuus niger介uum夕 va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBank A。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、 A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4% 和91.7%,而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用 公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级 结构预测进行分析,结果表明,黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N- 糖基化位点,与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基 化位点个数及位置完全相同,而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重 要;理论PI为4.95,分子量为5 n42.0,分子式为q6eH蝴3Ns990,消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个,正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结


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