一种用于转基因植物安全性控制的高效基因删除系统“Gene-Deletor”的构建

【摘要】： 人类一直致力于通过传统遗传育种的方法来提高作物产量和改善作物品质。但经过几千年的不断挖掘和利用，到了二十一世纪的今天，仅仅依靠传统遗传育种来达到改良作物的目的已经变得越来越困难。植物转基因技术的出现给人类解决粮食问题带来了新的希望。经过20多年的发展，植物转基因技术日臻成熟，转基因作物的种植面积迅速增加，其经济效益日渐显著。但自转基因技术诞生以来，科学界和社会公众对转基因植物生物安全性的担忧就一直存在，对转基因技术是否安全的争论从未停止。因此，如何通过生物技术等手段，解决转基因植物中的安全隐患，消除公众对转基因植物安全性的担心，已成为转基因植物推广和应用中必须解决的关键问题。 目前，人们对转基因植物生物安全性的考虑主要集中在：①外源基因可能对生态环境和生物多样性带来不利的影响。例如，转基因植物花粉或种子的扩散造成基因逃逸(Gene flow)，外源基因可能转移到杂草或近缘物种中，产生“超级杂草”；外源基因(如Bt基因)可能对非靶标生物构成潜在威胁等，这些都可能给生态平衡和生物多样性造成灾难性的后果。②转基因食品对人类健康的潜在危害。如一些杀虫、抗菌基因和过敏蛋白可能危害人类健康，以及抗生素抗性基因逃逸到人类病原微生物中，造成潜在危险等。 转基因植物巨大的经济价值和潜在的风险，使我们不得不考虑建立相应的技术体系，来解决转基因植物应用中的安全性问题，即如何在享受转基因技术带来福祉的同时，最大限度地消除其潜在的危险。为此，转座子(transposon)技术、共转化(co-transformation)技术和位点特异性重组酶(site-specific reombinase)技术等，已相继应用于转基因植物安全性的控制中。但是，目前这些技术主要是用于删除转基因植物中的抗性标记基因，并不能去除包括目的基因(如Bt基因)在内的所有外源基因，这些基因的存在同样可能带来转基因安全性问题。而且，已报道的这些系统，均存在删除外源基因的效率低、删除外源基因的周期长等缺点，远不能满足田间大规模种植的转基因作物安全性控制的需要。相对而言，在这些 摘要 技术中，位点特异性重组酶技术在转基因植物中研究较多、应用最为广泛，但现 有重组酶系统删除效率最高也只能达到80%左右，同样不能删除所有外源基因， 致使该系统难以应用于生产中解决转基因植物的安全性问题。 为了获得高效的基因删除系统，彻底删除转基因植物中所有的外源基因，解 决转基因植物可能带来的生物安全性问题，本论文针对现有重组酶系统存在的不 足，对影响删除效率的两个关键因素:重组酶的特异性识别位点和重组酶基因的 表达进行了研究，构建了具有融合识别位点的高效基因自动删除系统。在转基因 烟草的花粉和种子中，所有外源基因都被100%地删除，首次实现了在转基因植物 中获得非转基因的花粉和种子，为解决由于转基因植物花粉或种子扩散引起基因 逃逸的问题，提供了一个可行的技术手段。该系统命名为“Gene一Deletor”。论文 主要研究结果如下: 1.识别位点对位点特异性重组酶系统删除效率的影响 在位点特异性重组酶系统Cre/I oxP和FLP/F天T中，识别位点2以尸和FRT是 影响系统删除效率的关键元件之一。为了弄清识别位点对删除效率的影响，分别 比较了含有单识别位点FRT和融合识别位点IOxPFRT的重组酶系统在转基因植物 中的删除效率。为此，构建了四个表达载体，分别为:具有单识别位点尸尺T的载 体①pFBFGN(重组酶基因FLP由花粉特异性启动子BgP启动)和载体②pFLCGN (重组酶基因Cre由花粉特异性启动子Lat52启动);具有融合识别位点IOxP万天T 的载体③pLFBFGN和载体④pLFLcGN，重组酶基因FLP和cre的表达同样采用 上述启动子控制。将各个载体分别转化烟草，分析了在转基因植物花粉基因组中 外源基因的删除效率。 结果发现，在含单识别位点FRT的重组酶系统中，具有重组酶Cre基因的 pFLCGN系统和具有重组酶基因FLP的pFBFGN系统，最高删除效率分别为34.3% 和”.5%;而在含有7OxPF火T融合识别位点的重组酶系统中，无论是带有Cre基因 的pLFLCGN系统，还是具有FLP基因的pLFBFGN系统，其最高删除效率均达 到100%。表明融合识别位点(loxPF天T)可以显著地提高位点特异性重组酶系统 在转基因植物中的删除效率。 西南农业大学博士论文 2.启动子对位点特异性重组酶系统删除效率的影响 在位点特异性重组酶系统中，重组酶基因的表达(表达水平、表达时间及表 达组织特异性)是影响系统删除效率的另一个关键因素。论文选取①组成型启动 子(CaMv 355)，②组织特异性启动子(花粉特异性启动子BgP和花粉、子房以 及早期胚胎特异性表达启动子pABS)，③诱导性启动子(热激蛋白启动子 HsP 18.2)，分别控制重组酶FLP基因的表达，比较了在不同类型启动子引导下， 重组酶FLP基因表达对均含有融合识别位点系统删除效率的影响。 结果表明:①在组成型启动子CaMV 355启动重组酶FLP基因表达的转基因 烟草中，其最高删除效率只能达到66.8%。与野生型植株相比，转基因植株的生长 受到抑制，叶片出现畸形?