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甘蓝型油菜CHSA、CHSB基因以及WRKY44同源基因片断的克隆与序列分析

杨成军  
【摘要】: 甘蓝型油菜(Brassica napus L)是世界主要油料作物之一,也是我国最大的油菜籽作物。提高单产的同时提高油菜籽的含油量和品质一直是当代油菜育种的核心目标,采用现代生物技术结合常规育种创造含油量高、蛋白质含量高、种皮薄、纤维素含低的黄籽油菜品系(种)是当前油菜研究中的一个热点。拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的研究表明,在其种皮色素形成的多个分子生物学与生物化学步骤中,任何一步的功能失活性突变均会导致种皮色素沉积的阻断或弱化,从而使种皮颜色由传统的深褐色变为黄色甚至透明种皮,目前在拟南芥中已鉴定出21个透明种皮基因(Transparent Testa,TT)位点。油菜与拟南芥同属于十字花科,且甘蓝型油菜种皮色泽形成方式与拟南芥很相似,因此借鉴拟南芥透明种皮分子生物学研究的成果,是研究甘蓝型油菜种皮色泽分子机制和开展油菜种皮色泽基因工程的重要理论依据。天然甘蓝型油菜没有黄色种皮,而采用人工合成四倍体或从其近缘种进行黄籽性状转育而得的黄籽甘蓝型油菜又存在着色泽不稳定、黄籽度和黄籽率不理想等弱点。阐明甘蓝型油菜黄籽形成的遗传学与分子生物学机理、克隆黄籽基因以及采用基因工程的方法创造人工黄籽甘蓝型油菜是当前甘蓝型油菜品质研究中的一个重要课题。 查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物黄酮类和花青素类色素形成步骤中的一个关键酶,因此是种皮、花瓣等器官色泽形成的重要酶类,在拟南芥中CHS的功能突变被鉴定为导致透明种皮的IT4位点。WRKY44基因编码一种蛋白调控因子,在拟南芥的内种皮单宁类色泽的形成中具有关键作用,其功能性失活在拟南芥中被鉴定为形成透明种皮的TTG2位点。鉴于CHS和WRKY44在拟南芥等十字花科植物种皮色泽形成中的重要功能角色,本研究以甘蓝型油菜为材料,根据已报道的甘蓝型油菜CHS基因的序列设计引物,从黑籽和黄籽材料中分别克隆得到了甘蓝型油菜CHS基因家族中的两个成员CHSA和CHSB的序列,并进行了对比分析,力求寻找所研究的甘蓝型黄籽油菜黄色种皮的形成与CHS的关系。同时根据拟南芥WRKY44基因的保守序列设计引物,从黑籽甘蓝型油菜中克隆获得WRKY44基因序列,并进行了序列分析。 西南农业大学硕士学位论文 采用扩增C月叹咬基因的引物从甘蓝型油菜的黑籽和黄籽材料中分别进行咒R扩增,均得到一条约 1300bP的清晰条带,分别回收、亚克隆、测序和进行生物信息学分析,均得到一个1287t甲的、与已 知甘蓝型油菜C月叹搜2基因序列基本一致的基因序列。已登录的口召刁2是一个有完整开放读码框的编 码查尔酮合酶的功能基因,因此可以推断,本研究中所采用的黄籽和黑籽甘蓝型油菜品系在C洲叹峨2 基因位点上不存在差异,这两种材料均具有C石叹JZ的活性编码基因,也就是说此处所用的甘蓝型黄 籽油菜的黄籽形成甫U理与C石区峨2基因没有关系。采用扩增Cl朽碑基因的引物从甘蓝型油菜的黑籽和 彭哗子材料中分别进行陀R扩增,均得到一条约1500bP的清晰条带,分别回收、亚克隆、测序和进行 生物信息学分析,结果从黑籽油菜中获得一个巧14bP、与已知甘蓝型油菜〔华巧石1基因序歹小盛本一致 的基因序列,但从黄籽油菜中则获得了一个15(X)bP的与C伙留1基因序列有较大差异的同源基因序列。 BLAsT同源性分析表明,本研究中的黑籽材料具有与已知的甘蓝型油菜C翻妞1基因完全丫翻的功能 基因:但黄籽材料则没有扩增出该基因序列,其原因有可能是这个黄籽材料本身就缺乏该基因,也有 可能是存在该基因但PCR扩增中被另一同源基因的扩增而抑制了,因此没被克隆出来.此处从黄籽材 料中克隆获得的是一个C狱别和C产朽万基因的同源基因,除去243饰~匆只扣之间的加3坤内含子之 后的外显子序列与甘蓝型油菜本身的C伙叼和Cl乃毋基因mRNA的核昔裁湘似性只有盯%畏姚左右, 而与甘蓝(肠仍£如口距~L.)的〔梦心基因的n1RNA贝惰97%至翎肠的同源性,其开放读码框(诉”1 l侧司ing行田nc,ORF)及推导的蛋白序列与甘蓝〔决‘基因几乎一样。据此可以推断,本研究中的旧目蓝型 黄籽油菜中具有从甘蓝中转移而来的甘蓝C月叹基因,很可能缺失了甘蓝型油菜本身应该具有的C子绍召1 基因.这种一得一失的分子遗传学效应也许来自于种间远缘杂交后染色体片断的同源交换与重组过程。 事实上追溯该黄籽材料的来源,的确是由黄籽甘蓝与黑籽甘蓝型油菜杂交后再与甘蓝型油菜多代回交 而选穿而来。本研究的结果似乎建议,该黄籽甘蓝型油菜的黄籽种皮形成也许与〔汤巧万】基因的同源 交换和重组有一定联系。 哭用拟南芥环欠尤1,44基因的保守引物,从黑籽甘蓝型油菜基因组ONA模板中扩增出了一条约 1 150bP的清晰条带,经克隆测序后得至卜个1153坤的序列.BLA盯同源性分析表明,该基因是甘蓝 型油菜中的一个与拟南芥理烈口闷4有较高同源性的新基因,此处命名为加弃丹伏】喇,它与拟南芥 仲天犬价目/77飞刃(AA阅拓200)的到字列相似性为82.4%,与其它植物即天犬r基因序列也有不同程度的 栩以性‘枷不件次1解在!的一1“bP和753一841沛处分别有一个6卿和89bp的预测内含子,其位置


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