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转苜蓿防御素alfAFP基因和苦瓜几丁酶McChit1基因提高番茄对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)抗性的研究

仝爱平  
【摘要】: 番茄是一种深受人们喜爱的重要蔬菜,同时也是最早进行转基因研究的高等植物之一。现在,用转基因技术已培育出延迟成熟、抗病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质等具有各种优良性状的番茄。利用现代分子生物学技术,向番茄基因组中导入外源基因,为番茄的遗传改良工作提供了一条有效的途径。 防御素(Defensin)是广泛存在于动、植物体内的一类富含半胱氨酸的抗菌肽,对细菌、真菌和被膜病毒等有广谱的毒杀效应。几丁质酶(Chitinase)具有降解几丁质的作用,可以破坏菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病原菌的生长,在防御病原真菌侵害中具有重要作用。一些几丁质酶具有溶菌酶的作用,能抑制细菌生长。 本研究在建立番茄材料Micro-Tom的稳定而高效的遗传转化体系基础上,将来自苜蓿的防御素基因alfAFP和苦瓜的几丁质酶基因McChitl以及这两个基因的双价(简称AC)分别导入Micro-Tom,并对转基因植株T_1代进行了青枯菌(R. solanacearum)抗性检测。主要结果如下: 1.研究了影响农杆菌介导番茄Micro-Tom的遗传转化的几个因素,结果表明:以子叶作为外植体,其转化后再生频率(76.0%)明显高于下胚轴(19.9%)和真叶(28.7%);共培养时间以2d再生效果最好;在重悬农杆菌的MSB培养液和共培养培养基中添加AS对于Micro-Tom的遗传转化是必需的,而其浓度对转化的影响相对较小,50μmol/L的AS即可。该转化体系稳定、高效,平均转化频率20%以上,植株生长正常。 2.对alfAFP基因,McChitl基因及其双价转基因植株进行GUS组织化学染色和PCR扩 西南农业人学硕!二学位论文 摘要 增检测,结果表明外源目的基因己经整合到番茄基因组中。 3.用3种转基因植株做总蛋白离体抑菌实验,结果表明口柳FP基因和放Chil]基因对 抗青枯菌井没有明显的协同作用;在转注C基因的转基因植株叶蛋白提取液中,起主要抗菌作 用的为a妇FP基因表达产物:转McChitl基因植株的n一卜片总蛋白也有一定的抑菌作用。 4.对转AC基因植株进行了初步的T:代幼苗根部接菌和茎部针刺接菌检测,结果表明转 化植株较非转化植株对青枯病菌的抗性增强。在幼苗根部接菌实验中转基因株系.L一9,L一21 和L一12分别比对照推迟发病ld,Zd和4d。接菌约lld后不再发病,此时二个株系比对照发 病率分别减少33.3%、44.4%和11.1%,对照发病率为100%。在茎部针刺接菌实验中,L一2! 与对照相比,对青枯菌的抗性增强。接菌后的前10d,对照发病较快,而转基因植株发病较慢, 至10d时比对照病情指数降低3834%;但10d以后,对照发病基本停_L匕而转基因植株继续 发病,其病情指数逐渐接近对照非转基因植株,至30d时与对照相比病情指数相差不大(5%),- 发病率也达到100%。同时也可以看到相同时期转基因植株茎部接菌部位的病斑平均较对照要 ,J\。 5.对随机挑取的转注c基因植株三个株系萌发的T。代种子进行Gus染色和xZ适合性测 验,结果表明其遗传规律均符合孟德尔规律,呈3:l单基因显性的孟德尔式分离。


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