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根瘤农杆菌介导的GNA基因转化马铃薯研究

孟千万  
【摘要】: 马铃薯为茄科茄属一年生草本植物,块茎富含淀粉为主要的食用部分,也是工业上的主要原料。原产南美洲,后被引种到世界各地广泛栽培,产量居世界第四位。由于栽培环境差异及育种学家的不断努力,已形成并培育出众多的马铃薯品种。由于生长周期短暂且富含丰富的淀粉,马铃薯非常容易受到病虫害的侵害,如各种真菌、细菌、病毒和昆虫等。传统的解决方法是通过遗传育种使自然界优良的抗性基因得以在物种内进行交换以达到虫害的防治。利用常规的育种方法尽管已培育出许多对各种病害表现出高抗的品种,但杀虫剂的广泛使用在杀死虫害的同时又促进了昆虫的快速进化导致昆虫对杀虫剂的抗性越来越高,极大的破坏了生态平衡也使传统的育种方法陷入困境。但随着分子生物学及基因工程技术的快速发展,通过导入外源基因使植物获得新的特性以增强对各种病害的抗性,不仅部分克服了传统育种上无法逾越的种间遗传物质转移,增加了物种资源多样性,还极大的缩短了新特性植物培育的时间且无明显的“副作用”。 将外源基因导入植物须借助于一定的转化方法。转化马铃薯常用的方法为根瘤农杆菌介导转化。根瘤农杆菌是一种能够侵染大多数双子叶植物并在其侵染附近形成根瘤的土壤细菌,致瘤过程实际上是农杆菌体内质粒上的一段DNA(T-DNA)转移进入植物细胞内并插到宿主植物体基因组上诱导宿主植物为其合成生存必须的冠瘿碱。而借助根瘤农杆菌转化的目的是使外源基因在T-DNA和vir基因的协助下与受体植物基因组相整合并在受体植物中表达产物。农杆菌介导转化技术操作简单,转化机理已研究的相当透彻,因此本实验用其来转化四川地区常见栽培的马铃薯品种。 但外源基因并非直接导入根瘤农杆菌然后再借助其转入受体植物体内,一则根瘤农杆菌上的致瘤基因仍会起作用,二则外源基因难以检测到,很容易受到污染,因此须借助中间表达载体使外源基因间接的借助根瘤农杆菌转移DNA的能力进入植物体内。已有众多的中间表达载体被构建出来,本实验中使用的表达载体为pCAMBIA1303,虽然未见到其用与马铃薯的转化,但与其相关的载体已有对多种植物转化成功的报道。 西南农业大学硕士学位论文摘要 白....,.....侧,....叫嗯月乒.......叫....-...-....叫尸.-......耳钾只,.,...甲甲.,~叫州户月口,.户.,叫惠耳照照 本实验中转化的外源基因为编码一种对多种昆虫都有毒杀作用的植物凝集素一雪花莲凝 集素,它对那些农业上难以控制的吮吸式昆虫如蚜虫、褐飞虱和叶蝉等毒杀效果也相当明显。 国外对其转化马铃薯研究的较多,但国内尚未见到报道。 本研究得到下面结果: 1.从四川地区常见栽培的n个马铃薯品种中根据它们在培养基上的生长情况、外植体细胞分 化再生能力选择出品种C、E、N和T作为实验材料。 2.根据不同部位组织器官细胞分化再生能力选择叶片和茎段作为最佳外植体。 3.成功构建雪花莲凝集素真核表达双元载体并命名为pcAMBIA1303一lecGNAZ。其中 lecGNAZ基因序列与CaMv35S启动子下游相连,但GUS基因被切除是个缺憾。 4.建立了高效的遗传转化体系,运用农杆菌介导的方法把雪花莲凝集素基因成功转入马铃薯 细胞内。PCR扩增检测到GNA已与马铃薯基因组整合。


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