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棉花油菜素内酯合成酶基因(GhDET2)在杨树上的遗传转化及转基因植株的表型分析

严飞  
【摘要】: 杨树是世界上最重要的人工林树种之一,在美化环境、生态防护和工业用材上具有极其重要的作用。我国是世界上杨树人工林面积最大的国家。但是我国人均林地面积、森林蓄积量和木材消耗量只占世界人均水平的17.2%、12%和17.6%。目前,天然林中可采资源濒临枯竭,大力发展人工杨将对缓解我国乃至世界森林资源渐趋缺乏、木材供需矛盾都起着非常重要的作用。 传统的杂交育种方法为杨树良种选育作出了巨大贡献,取得了很大成就;但是,由于杨树生长周期长、树体高大,这极大地限制了杨树传统育种工作的开展。在短时间内,用常规育种技术要培育出人们所希望的杨树新品种是非常困难。现代生物技术的兴起,为林木遗传改良提供了新的途径。植物基因工程通过基因操作将天然或构建的外源基因导入受体细胞基因组中进行遗传转化,从而打破生物种间杂交障碍、扩大物种杂交的范围,大大加快了变异速度,为木本植物定向育种提供了有效手段。 油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)早在1982年就被公认为是一类新型的植物生长促进剂,是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯五大类激素之后的第六大类植物激素。BRs参与植物生理过程的许多方面,对植物的生长发育具有多种生理功能,如:促进生长、增加植物的抗逆性、延缓衰老、促进细胞的再分化等等。但最突出的生理作用就是促进植物的生长。我国农业部已将它列入“中国丰收计划”进行广泛的推广应用,推广面积已接近1000万亩。 DET2是编码油菜素内酯生物合成途径中的一个关键酶基因,它的突变将导致植物表现出去黄化、矮化和丧失光调节机能等特征。而外施油菜素内酯能回复DET2基因突变所导致的突变体表型。这说明DET2基因在油菜素内酯生物合成以及植物正常生长发育中的重要作用。本研究将来源于棉花纤维中GhDET2基因置于CaMV35S强启动子下转化杨树。通过在杨树上超量表达DET2基因,增加杨树内源BRs的含量,进而促进杨树的生长,以期为杨树良种选育 西南农业大学硕上学位论文 摘要 提供新材料。主要结果如下: 1:‘建立了农杆菌转化毛白杨茎段的遗传转化体系 通过对毛白杨叶片、茎段、根段3种外植体再生频率的研究,确定了以茎段为外植体 的高频再生体系,再生频率为100%,平均每个外植体出芽数为21 .05个。进而利用带内 含子的G〔/S基因瞬时表达技术,以转化频率为指标,确定了利于转化的Km选择压,AS 浓度、菌液浓度、共培养时间,建立了根癌农杆菌介导毛白杨茎段的转化体系,即:用 500林 mollL的As二次稀释活化农杆菌菌液,待其oD.为0.3司.5时侵染杨树茎段 10一15min,24℃黑暗条件下共培养3d,黑暗条件下延迟筛选10d后以50m叭的Km进行 抗性芽的筛选培养,每20d继代一次,将筛选出的抗性芽继代到含相同Km浓度生根培养 基上再生成苗。 2·棉花油菜素内酷合成酶基因嘴hDETZ的导入 采用携带重组质粒pGhDETZ的农杆菌进行了目的基因的转化,获得了Km抗性芽15 个,5株生根成苗,经GUS组织化学染色及PCR扩增,其中3株GUS染色为阳性并扩增 出了与阳性对照相同大小的特异条带(892bP),说明外源基因已整合到杨树的基因组中. 3.转GhDETZ基因杨树的表型分析 将其中GUS染色较深且表型较明显的一株及对照同时进行扩繁,再生苗移栽入土钵,观 察其表型变化,结果发现转化植株与对照相比,其株高、茎粗、节间长度、分枝数均明显高 于对照;切取转化植株的茎段进行水培,观察其生根情况,发现超量表达GhDETZ基因杨树 的根系生长快而粗壮,侧根发达:对转化植株茎段切片的显微结构观察发现,转基因杨树木 质部的厚度、木射线细胞数、导管密度和木纤维的细胞密度均显著高于对照。分离出转化植 株的木质部纤维细胞,发现超量表达GhDETZ基因杨树的木质部纤维细胞平均增长148林m, 比对照提高了297%。


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