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抗人大肠杆菌免疫鸡蛋黄抗体的研究

王勇德  
【摘要】:高免蛋黄抗体具有生产过程简单、效率高等特点,已越来越多地应用于人类许多疾病的预防和治疗以及生物学的高度特异性检测等领域中,并取得显著成效。本文主要研究了以人致病性大肠杆菌为抗原,免疫母鸡,研究获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件;建立快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定蛋黄抗体(IgY)效价的技术;研究抗人大肠杆菌IgY分离纯化条件及其理化、生化特性;研究食品加工过程中的各种因素对大肠杆菌特异IgY生物活性的影响;探讨抗人大肠杆菌免疫鸡蛋抗体的功能及其机理;评估蛋黄抗体的安全性。主要获得如下结果: (1) 对获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件研究发现: (a) 以大肠杆菌悬浮液对20周龄京白蛋鸡免疫时,若固定免疫抗原剂量为0.5ml,则当菌液浓度低于1×10~9 cfu/ml,免疫应答强度随免疫剂量的降低而降低,当菌液浓度高于1×10~9 cfu/ml时,免疫应答强度不会随免疫剂量的增加而得到明显加强。因此,确定最佳免疫剂量为每次0.5ml菌液浓度为1×10~9 cfu/ml的大肠杆菌悬浮液。 (b) 在大肠杆菌悬液中添加等量的福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂和白油佐剂能明显加强免疫应答强度,其中福氏完全佐剂对免疫应答加强的程度最高。 (c) 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、颈背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和颈背肌肉注射8种不同免疫途径对免疫应答反应强度没有明显影响。 (d) 强化免疫程序能大大加强产蛋母鸡的免疫应答强度,其中初免后,每隔1周强化免疫一次,连续4次,此后每1月仅用佐剂抗原强化免疫1次的强化免疫程序既经济又有效。 (2) 采取热酚法提取E.coli LPS作为抗原,以酶标记的兔抗鸡IgY抗抗体(IgG)为二抗建立起来的间接ELISA技术检测特异蛋黄抗体IgY的抗体效价,以酶标二抗工作浓度为1:2000,LPS抗原包被浓度为1:20(10ug/ml),可以检测到鸡特异IgY抗体效价为1:10240。用猪源EHEC和人源沙门氏菌的LPS抗原进行了交叉检测,表现出高度的特异性。 (3) 通过对蛋黄抗体(IgY)的分离纯化条件研究发现,乙醇沉淀抗体的最佳条件是粗提液:乙醇(V/V)为1:0.35;经DEAE-Sephrose fast-flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶排阻层析连续纯化后可得到电泳纯的抗人大肠杆菌IgY,其MW为186400Da(电泳法)或186500Da(凝胶过滤法),该抗体由两个亚基构成,分子质量分别为65900Da和24600Da,其等电点为5.5。 (4) 通过稳定性研究发现: (a) 抗人大肠杆菌IgY抗体在高温下(≥75℃)容易发生热变性,其热变性的反应级数为1.5,其热变性温度点为75.0℃。 西南农业大学博l:学位论文 (b)抗人大肠杆菌抗体在酸性环境容易发生变性,而在中性和弱碱性环境中能较好的保 持稳定,其主要变性发生在pH2.5一3.0。 (c)胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对抗人大肠杆菌抗体的活性保持均有不利的作 用,但发现,经上述3种消化道蛋白质水解酶部分作用后形成的抗体水解物仍具有一定的抗 体活性。进一步研究确定,在灌胃后lh内,小肠内抗体活性基本保持在最高水平,而在Zh 之后,抗体活性大幅度下降,在灌胃后16h已经下降到了非常低的水平。 (d)将抗人大肠杆菌抗体贮存在O℃和4℃是比较合适的,若贮存在25℃以上的温度下, 抗体活性损失随贮存期的延长而不断下降。 (e)加热处理、蛋白酶处理以及冷冻干燥处理对抗体的活性都有不利的影响,但一定浓 度的乳糖、环糊精和糊精能加强抗体对热处理和蛋白酶处理的稳定性,而环糊精、乳糖、糊 精、果糖、葡萄糖、甘氨酸和甘油都能不同程度的加强抗体在冷冻干燥过程中的稳定性。 (5)通过对抗人大肠杆菌免疫蛋黄抗体的功能及其机理探讨发现,抗人人肠杆菌卵黄抗体 浓度大于sm留ml,可对大肠杆菌有明显的体外抑菌作用;抗人大肠杆菌IgY对大肠杆菌诱导 的乳鼠肠道感染具有显著的预防和治疗作用;抗人大肠杆菌卵黄抗体可抑制大肠杆菌对肠上 皮细胞粘附作用,随着大肠杆菌浓度的不断升高,粘附率不断增加,上皮细胞浓度的增加能 提高ETEC对其的粘附率。 (6)研究发现,4.0 kGy的“。c。丫射线可使蛋中可能污染的微生物全部灭活,而不影响 抗体活性;鸡抗人大肠杆菌抗体对临床检查、血液学、生化学、器官重量、系数及组织病理 学等指标无明显影响,证明鸡蛋黄抗体IgY无急、‘漫性毒副作用:通过骨髓嗜染红细胞微核 试验、小鼠精子畸形试验及Ames试验,结果证明鸡抗人大肠杆菌抗体无细胞毒,无致突变作 用。 关键词:蛋黄抗体制备分离提纯稳定性功能食品


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