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烟草甲基化模式的MSAP分析和甲基化相关基因的克隆

焦俊娜  
【摘要】:烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物和模式生物之一。随着农业生产的发展和人民生活水平的提高,人们对烟叶的产量、品质都提出了更高的要求。而烟草在长期的培育下,遗传背景比较狭窄,长期依赖国外引进品种。分子标记是辅助育种的一个重要手段,在遗传图谱构建和重要性状基因定位等方面也有重要的应用。 本研究以丰富烟草种质资源,提高烟叶质量,增强我国烟草行业在国际竞争中的实力等方面为出发点,采用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术,甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术和基因克隆技术,重点对基因组DNA甲基化修饰水平、模式及位点等表观遗传信息和甲基化相关基因序列做了进一步的鉴定分析,实验结果如下: 1、烟草基因组DNA的AFLP电泳图谱多态性 本研究采用用11个EcoRⅠ和MseⅠ引物组合对2009年在四川雅安、兴文和姚佳所取的云烟85,NC89(北卡89),K326,云烟87四个烟草品种的六个样品基因组DNA进行了AFLP的聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)。结果显示,图谱多态性普遍较差。然后用同样的引物组合扩增了2009年和2010年在四川广元、泸州和宜宾所取的云烟87基因组DNA,扩增产物的PAGE电泳图谱显示,11对AFLP引物组合在242个位点扩增出清晰可辨且可重复的DNA条带。多态性统计结果表明,地域条件与年份相比,地域条件对材料AFLP指纹图谱多态性的影响更大。 2、烟草基因组DNA甲基化模式的多态性 实验采用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于烟草基因组的“甲基化敏感扩增多态性”分析体系,在全基因组水平检测了四川雅安、兴文和姚佳所取的云烟85,NC89,K326,云烟87四个烟草品种的六个样品的甲基化修饰位点。研究通过比较六个烟草样品间的MSAP扩增指纹图谱,对DNA甲基化位点模式进行了分析总结。结果表明,地理位置和取样时间相比,烟草基因组DNA甲基化情况受地域影响更大。本研究中甲基化位点比例最低29.72%,最高为43.37%,印证了植物研究中MSAP对于基因组DNA甲基化检出率在4.7%-45%之间的报道。实验结果丰富了烟草基因组甲基化方面的研究内容,为今后烟草表观遗传学的研究提供了一定的参考。 3、烟草基因组DNA甲基化片段序列 对部分烟草基因组甲基化修饰位点DNA片段进行回收克隆,通过进一步的序列比对,从中鉴定出了烟草基因组DNA,几丁质酶基因,硝酸盐还原酶基因,光和系统PSI-H前体基因,叶绿体DNA,线粒体DNA,鸟氨酸脱羧酶基因,核酮糖羧化酶基因等同源序列及启动子序列中存在DNA甲基化修饰现象。试验结果丰富了高等植物基因组甲基化检出位点的多样性。依据“CpG island"的定义,对烟草甲基化DNA片段中CpG二核苷酸分布特征做了进一步分析,结果表明烟草基因组中“CpG”二核苷酸成簇富集区域是DNA胞嘧啶甲基化修饰的潜在位点。 4、烟草基因组DNA甲基化相关基因序列 烟草硝酸还原酶,鸟氨酸脱羧酶,核酮糖脱羧酶三个基因克隆分析的结果表明:(1)各个模板扩增的基因序列与各个引物GENBANK上寻找的基因mRNA序列比对结果显示,1,5—二磷酸核酮糖羧化酶基因的各个模板基因序列外显子部分相似度差异较大,推测是由于基因较长,各品种在进化中基因序列发生了变异。(2)内含子序列分析结果显示,地方性晾晒烟品种相对于烤烟品种的内含子部分相似度差异较大,推测这种研究结果与试验所采用的几个烤烟品种的亲缘关系较近有关。(3)比较分析各个模板的甲基化相关基因的甲基化部分和甲基化相关基因的基因结构,发现基因的甲基化部分有些分布在基因的内含子区域。内含子区域包含了生物进化过程中的很多信息,而甲基化作为表观遗传学研究的一部分,具有可遗传的特性,因此甲基化和内含子进化应该存在着某种关系,但还需要进一步的实验研究。


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