产皂苷的重楼内生真菌的分离、鉴定及退化研究

【摘要】：重楼,是百合科重楼属植物的泛称,其在云南和四川分布最为集中。《中华人民共和国药典》(2010年版)收录了滇重楼(Paris Polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz)和华重楼(Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara)两个变种。重楼以干燥根茎入药,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效。是“抗病毒冲剂”、“云南白药”和“宫血宁”的主要原料之一。重楼主要药用成分为甾体皂苷类物质,其具多种生理活性,有很高药用价值和开发潜力。重楼作为我国重要中成药的原料,需要量逐年增加,但由于其生长缓慢,繁殖系数低等,蕴藏量大大减少,已逐渐难以满足生产所需。近年来的研究表明,许多植物的内生真菌可以产生与寄主药用植物相同的药用成分。本试验以采自重楼资源比较丰富的四川天全的野生华重楼为材料,分离了其不同生长发育阶段内生真菌,对能产生皂苷的内生真菌进行了鉴定及其皂苷产量的分析,并开展了其产皂苷能力退化的初步研究,以期为进一步开发利用重楼资源,采用微生物发酵生产重楼药用成分,解决重楼资源短缺奠定基础,提供科学依据。主要研究结果如下： (1)在华重楼3个不同生长阶段分别采取3种不同培养基进行其内生真菌的分离,结果共分离得到15种不同真菌。其中8种在3个生长阶段均分离到。试验还发现,同种培养基在不同季节分离真菌的平均数差异较大,3-4月和12月-次年1月分离的平均菌落数和分离总类数高于7-8月间的平均菌落数和分离总类数,且以MPDA培养基分离效果相对较好。 (2)将8种在三个生长阶段均分离的华重楼内生真菌(编号分别为WD7H、Cp、A221H、WD9H、A4H、XIA2X、WD6H、W2.1H)进行显微鉴定,初步鉴定分别为镰孢菌属、水霉目、球科目、毛霉目、曲霉属、曲霉属、镰刀菌属和隔孢纲目真菌。 (3)采用发泡性试验以及薄层层析(TLC)方法对这8种内生真菌的发酵产物进行检测,确定有4种真菌(WD6H、WD7H、XIA2X和A221H)次生代谢产物中有重楼皂苷成分。进一步采用紫外分光光度法对其产皂苷元进行定量检测,发现其发酵液中的皂苷元产率分别为3.61mg/L、2.72mg/L、3.36mg/L和1.98mg/L。 (4)采用真菌保守序列ITS序列对4种产皂苷的真菌进行分子鉴定,认为WD6H为腐皮孢霉菌(Fusarium solani)、WD7H为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、XIA2X为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、A221H为大团囊菌科红曲霉(Monascus fumeus)。 (5)对能产生皂苷的WD6H、A221H进行菌种退化试验研究。结果发现,WD6H第1代菌丝可产皂苷0.68mg/mL,第5代菌丝仅产皂苷0.012mg/mL;A221H第1代菌丝可产皂苷0.49mg/mL,第5代菌丝仅产皂苷0.076mg/mLo即经过体外培养若干代后,重楼内生真菌产皂苷能力逐渐退化,如何保证重楼内生真菌产皂苷成分的能力稳定遗传,将成为下一步研究重点。