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大熊猫CRYAB基因及大熊猫和四川黑熊TNNC1基因的克隆和相关研究

侯怡铃  
【摘要】:大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀大型野生动物,属国家一级濒危保护动物,主要分布于四川西部和北部、甘肃南部、西藏东部及陕西西南部,主要取食箭竹,被世界自然保护联盟(IUCN)和《中国濒危动物红皮书》列为濒危物种,它是动物界最耀眼的明星,深受人们的喜爱,有“国宝”和动物“活化石”之称,也是全球野生动物保护的“旗舰物种”,在我国经济、社会、文化及对外交往中扮演着十分独特而重要的角色,具有极高的生态、科研、经济、文化和美学价值。四川黑熊(Ursus thibetanus mupinensis)被人称之为月熊、喜马拉雅熊或藏熊,是杂食性动物,以植物为主,主要分布在亚洲南部,被列入国际野生动植物濒危物种公约,国家2级重点保护野生动物和中国濒危动物红皮书,这两种动物都具有特殊的科学研究价值和观赏价值。多年来,大熊猫和四川黑熊研究主要集中在诸如育种和繁殖,生态,形态,分类学,生理学和病理生化等领域。最近,在遗传多样性,起源和系统发育等领域有较大发展,而在功能基因研究领域的报道屈指可数。本研究从分子水平上对大熊猫和四川黑熊进行研究。 1、研究内容,目的及创新性 本研究以大熊猫和四川黑熊骨骼肌为材料,从大熊猫和四川黑熊骨骼肌组织中提取总RNA和基因组DNA,运用RT-PCR和Touch-downPCR分别扩增出CRYAB基因和TNNC1基因的cDNA和结构基因序列,对其序列进行比较、分析,并且构建了含有CRYAB和TNNC1 cDNA的重组表达载体,转化进入E.coliBL21进行超表达研究。目的是弄清楚大熊猫CRYAB基因和TNNC1基因的结构特征,超表达研究为进一步纯化CRYAB和TNNC1蛋白和分析其结构和功能奠定了基础,为更深入开展大熊猫和四川黑熊分子生物学研究提供科学方案与经验。 目前对大熊猫和黑熊功能基因及其生物学功能探索相对较少,对大熊猫CRYAB基因和TNNC1基因还没有任何相关研究。本研究以最珍稀的大型野生动物大熊猫作为研究对象,运用现代分子生物技术为研究手段,对该两个基因的序列特征及其表达情况进行全面研究,其研究成果可为进一步开展大熊猫和黑熊众多功能基因及其生物学功能的研究积累经验,还可从本研究中还获得对研究其他动物相应基因具有重要意义的信息,所以本研究属原创型基础研究。 2、主要成果及结论 本研究运用RT-PCR技术和Touch-down PCR,分别成功克隆并表达了大熊猫CRYAB基因和TNNC1基因的表达序列,并对其进行了测序及分析。 结果显示: 1.克隆的大熊猫CRYAB基因的cDNA片段包含一个528bp编码175个氨基酸的开放阅读框,其结构基因全长3189bp,包含3个外显子和2个内含子。该基因与已报道的人、褐家鼠、小家鼠和西藏黄牛4个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为93.9%,91.5%,91.5%和95.3%,氨基酸序列同源性分别为98.3%,97.1%,97.7%和99.4%。拓扑预测表明,大熊猫CRYAB蛋白只有四个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。将CRYAB基因在大肠杆菌中表达发现CRYAB蛋白与氮端多聚组氨酸标签蛋白(His6)融合成大小为24KD左右的多肽,这与预期结果相一致。 2.克隆的大熊猫TNNC1基因的cDNA片段包含一个602bp编码161个氨基酸的开放阅读框,其结构基因全长2831bp,包含6个外显子和5个内含子。克隆的黑熊TNNC1基因的cDNA片段包含一个486bp编码161个氨基酸的开放阅读框,其结构基因全长2758bp,同样包含6个外显子和5个内含子。该两个物种的TNNC1基因与已报道13个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性。拓扑预测表明,大熊猫和黑熊TNNC1蛋白有1个蛋白激酶C磷酸化位点;5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;1个N-豆蔻酰化位点;3个EF手性钙结合域及1个N-糖基化位点。将TNNC1基因在大肠杆菌中表达发现TNNC1蛋白与氮端多聚组氨酸标签蛋白(His6)融合成大小为23.5KD左右的多肽,这与预期结果相一致。


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