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H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究

张博  
【摘要】:猪流感(swine influenza, SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)引起的急性接触性呼吸道传染病。临床症状常见发烧、精神颓废、食欲减退、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、流产,并以高发病率和低死亡率为特征。猪流感是全球猪群常见疫病,虽不直接造成猪只大面积死亡,但是能严重削弱患病猪只健康状态和生产性能,延迟其上市,影响猪只的经济效益,同时其在猪只呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)中的重要地位已得到了广泛的认同,对养猪业的危害虽不及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征,但仍不容忽视。高效、准确的检测技术和安全可靠的疫苗是防控SIV的关键,也是目前猪病研究的热点方向。本研究从四川境内某发病猪场分离鉴定了一株H1N1亚型猪流感病毒,建立了基于NSl基因编码蛋白可区别野毒和灭活疫苗的间接ELISA方法,研究了自行构建含猪流感病毒三个M2e拷贝多肽序列的相关生物活性,并分别以猪IL-18和伪狂犬病病毒VP22作为分子佐剂,研究了M2e重组质粒的免疫效力和佐剂对其的影响及其与HA融合联用时的免疫保护效果。 1.H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定 分别用鸡胚和MDCK细胞分离鉴定了A/Swine/Sichuan/37/2009 (H1N1)猪流感病毒,对其相关生物学特性进行了初步研究;通过对其HA及NA全基因序列的测序分析,发现分别与人源H1N1亚型流感(A/Gunma/07G002/2008和A/Guangzhou/665/2006)同源性很高,核苷酸序列同源性分别达99.4%和99.7%。遗传进化树分析该毒株很可能来自于近年来流行于人群的H1N1亚型流感病毒;基于A型流感病毒NS基因保守性序列建立的RT-PCR诊断方法,具备良好的敏感性和特异性,初步证明可以在临床上快速、准确检测猪流感病毒。 2.猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立 克隆猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006(H3N2)的NS1基因,通过对其的序列分析发现多个亚型毒株NS1基因同源性较高且存在6个较保守的抗原决定簇。利用克隆获得的NS1基因片段构建原核表达载体,经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE电泳结果显示所表达的融合蛋白大小为43.5KD;Western-blotting结果显示,该蛋白可以与SIV阳性血清发生特异性的免疫反应,以NS1融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法有较高的特异性和敏感性,并能够区别野毒感染和灭活疫苗免疫猪只,证明通过NS1蛋白作为抗原建立鉴别ELISA诊断方法进一步开发成熟的试剂盒是可行的。 3.M2e原、真核表达研究及生物活性研究 利用重叠PCR方法构建含A/Swine/Sichuan/01/2006(H3N2)三个M2e拷贝的基因序列,分别构建原核、真核表达质粒。原核表达融合蛋白大小约为29KD,Western-blotting结果显示该蛋白可以与H3N2和H1N1亚型流感病毒阳性血清发生免疫反应,同时以此融合蛋白免疫小鼠可制备高效价(GMT=14336)的可识别受流感病毒感染的细胞外膜上的抗原成分的抗体,此抗体不具备体外中和病毒特性但是可以在小鼠体内发挥被动免疫保护效果,帮助小鼠抵御致死剂量病毒和异源毒株的攻击;M2e*3真核表达载体在体外可以在细胞内高效表达,为后续研究重组质粒免疫效力奠定基础。 4.猪白介素18(IL-18)及伪狂犬VP22作为分子佐剂的初步研究 构建猪IL-18真核表达质粒,该质粒可在细胞内表达IL-18(400.6±21.88μg/L)并可更好地活化小鼠脾淋巴细胞增殖的潜力(SI=3.016±0.244);PCR扩增伪狂犬病毒Fa株VP22基因序列,经测序分析发现该基因与Kaplan和Ea株同源性很高。将VP22插入pEGFP-N3载体中EGFP基因上游,构建真核表达质粒,转染细胞后发现其能够转录及表达,继而将其与HA以融合形式构建真核表达重组质粒免疫小鼠,pVP22-HA免疫组HI抗体水平(230.4+57.24)显著高于pCI-HA免疫组(102.4+35.05)。 5.M2e重组质粒免疫效力及IL-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究 分别构建pCI-M2e*3、pM2e*3-IRES-IL 18和pVP22-M2e*3真核表达重组质粒,并将它们在体外转染Vero细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光法证明它们均可转录表达。三种质粒免疫小鼠后均不同程度激发了小鼠体液免疫和细胞免疫水平,其中pM2e*3-IRES-IL18和pVP22-M2e*3多项指标均显著高于pCI-M2e*3,说明IL-18和VP22均针对M2e发挥了佐剂作用;小鼠遭受致死剂量攻毒后,三组免疫组从体重丢失率和存活保护率来看所诱导的免疫保护效果均不理想,特别是存活保护率也只有pVP22-M2e*3组仅达到了30%,而其它两组均为10%。在遭受中等剂量攻毒后,pVP22-M2e*3组相对于对照组不能减轻肺部病理损害程度;另外pVP22-M2e*3有一定异源保护能力。 6.M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 将M2e*3的C端与HA基因融合构建真核表达重组质粒pM2e*3-HA,该质粒可在细胞内转录表达;pM2e*3-HA免疫小鼠后,所激发的M2e特异性抗体水平显著高于pCI-M2e83组,HI抗体水平与pCI-HA组几无差异,而中和抗体稍高于后者但不显著;小鼠经致死剂量病毒攻击后,pM2e*3-HA在体重丢失率表现理想,存活保护率达100%,在遭受中等剂量攻毒后能减轻肺脏病理损害程度;同是对于异源病毒攻击的保护也较理想。M2e与HA的联合应用为新型猪流感疫苗的研究提供了一条新的思路。


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