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猪β-防御素基因表达特点及精氨酸的调节作用

齐莎日娜  
【摘要】:防御素(β-defensin)是抗微生物免疫的直接效应分子,在防御多种细菌、真菌、原虫和病毒对机体的入侵中发挥了重要的作用;此外,它还在先天性免疫和获得性免疫之间起到桥梁作用。精氨酸(arginine, Arg)是一种免疫增强剂,对动物免疫器官发育、细胞免疫和体液免疫都有影响,且在缓解动物应激中发挥重要作用。但是,目前关于猪防御素(porcineβ-defensin, pBD)基因表达规律及Arg对pBD表达的调节作用尚未见报道。因此,本研究旨在通过2个体内试验和2个体外试验考察pBD基因表达在不同品种和不同组织之间的差异以及Arg处理对其表达的影响,从而揭示pBD基因的表达特点和Arg对其表达的调节作用。 试验一DLY和藏猪pBD-1、2和3基因表达差异的研究 为了比较pBD-1、2和3基因在DLY猪(杜×长×大杂交猪)和藏猪组织中的表达差异,本试验选取健康的7日龄藏猪和DLY猪各6头,屠宰后立即取其心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤、肌肉、口腔黏膜、呼吸道上皮、舌、胸腺、小肠黏膜、生殖道上皮、睾丸(公)或卵巢(母)等组织器官,提取总RNA,用Real-time PCR方法检测pBD-1、2和3基因mRNA表达水平。结果表明:试验所取组织中均能检测到pBD基因mRNA的表达。pBD-1和3表达量最高的组织是舌和口腔黏膜,且藏猪大部分组织中pBD-1和3基因mRNA表达量要高于DLY猪;而pBD-2表达量最高的组织是肾脏和肝脏,且DLY猪大部分组织的pBD-2基因mRNA表达量高于藏猪。结果表明,pBD的表达存在明显的品种差异和组织特异性。 试验二Arg、Ile和Zn2+对IPEC-J2细胞系pBD-1、2和3基因mRNA与蛋白表达的影响 为了研究Arg、异亮氨酸(Isoleucine, lle)和Zn2+对pBD-1、2和3基因mRNA与蛋白质表达水平的影响,本试验以猪肠上皮细胞系IPEC-J2为体外研究模型,在无血清DMEM/F12培养基内分别单独添加不同浓度的Arg、Ile和Zn2+培养细胞,处理24 h后,分别提取总RNA和蛋白质。用Real-time PCR法测定pBD-1、2和3基因mRNA表达水平,用ELISA方法测定pBD-1、2和3蛋白质含量。结果显示,Arg、Ile和Zn2+均能够不同程度的诱导猪肠上皮细胞系pBD基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。其中,不同处理浓度的Arg均能提高pBD的基因和蛋白的表达,且以100μg/mL Arg是刺激pBD-1、2和3基因mRNA和蛋白质表达的最适浓度。Ile和Zn2+诱导pBD表达的最佳浓度分别是25μg/mL和100μmol/mL但其诱导作用均弱于Arg。结果表明,在本试验浓度范围内,Arg、I1e和Zn2+可以促进pBD-1、2和3基因mRNA与蛋白的表达,且以Arg对pBD-1、2和3表达的促进作用最优。 试验三Arg对DLY仔猪pBD-1、2和3基因表达的影响为了探讨Arg在体内对断奶仔猪pBD基因表达的调节作用,本试验选取产期、胎次和饲养环境相近的21日龄断奶DLY仔猪36头。采用2x3因子试验设计,按体重相近的原则随机分为6组。试验全期,1、4组饲喂基础日粮,2、5组饲喂基础+0.5%Arg日粮,3、6组饲喂基础+1% Arg日粮。试验第8d早上,空腹称重后,处理4、5、6组,共18头仔猪,通过接种4 mL S.C500(猪霍乱沙门氏菌C500)建立免疫应激模型,1、2和3组注射生理盐水。免疫应激后第10d屠宰取样。结果表明: 1.日粮添加Arg有增加仔猪平均日增重和日采食量趋势,且显著地降低耗料增重比。接种S.C500诱导的免疫应激降低了仔猪生产性能,极显著降低了仔猪接种S.C500后7d和全期日增重,极显著降低接种S.C500后一周的采食量,免疫应激后耗料增重比有降低的趋势;S.C500诱导的免疫应激仔猪补充Arg有改善生产性能的作用。 2.日粮中添加Arg可降低仔猪应激前及应激后1、3、7和10d血清中尿素氮水平;S.C500诱导的免疫应激提高了应激后1、3、7d血清尿素氮水平。添加Arg和接种S.C500在应激后1和7d对尿素氮的产生的影响具有互作效应,且日粮中1% Arg的添加对免疫应激仔猪血清尿素氮的降低幅度优于日粮中0.5% Arg的添加。 3.对于未接种S.C500的仔猪,日粮中添加Arg提高血清游离Arg(应激前及应激后1、3、7和10 d)、鸟氨酸(应激前及应激后1、3、7和10 d)、和瓜氨酸(应激前及应激后3和7 d)浓度,降低苏氨酸(应激后1 d)、蛋氨酸(应激后1、3、7和10 d)、缬氨酸(应激后1 d)及组氨酸浓度(应激后7 d);接种S.C500诱导的免疫应激导致血清赖氨酸(应激后1、3、7和10 d)、蛋氨酸(应激后1、3和7 d)、缬氨酸(应激后1、7和10 d)和苯丙氨酸(应激后1、3、7和10 d)浓度增加,Arg(应激后3 d)、瓜氨酸(应激后1和3 d)和苏氨酸(应激后1、3和10 d)浓度降低。添加Arg和接种S.C500对蛋氨酸(应激后3和7 d)、亮氨酸(应激后7d)、苯丙氨酸(应激后7 d)和瓜氨酸(应激后7 d)浓度的影响具有互作效应。 4.日粮添加Arg增加了血清NO含量(应激前)、TNOS (应激后7 d)和iNOS(应激后1、3和7d)活性,cNOS活性没有变化;接种S.C500增加血清NO(应激后10 d)含量、TNOS(应激后7d)和iNOS(应激后3和7 d)活性。添加Arg和接种S.C500对血清NO含量、TNOS和iNOS活性的影响无互作效应。 5.日粮中添加Arg增加了血清IgA(应激后3、7和10 d)、IgG(应激后1、3、7和10d)和IgM(应激后3d)的含量。接种S.C500增加血清IgA(应激后3d和10d)、IgG(应激后1 d、3 d和10 d)和IgM(应激后1 d、7 d和10d)含量。添加Arg和接种S.C500对血清IgA、IgG和IgM的影响无互作效应。 6.日粮添加Arg降低了血清IL-1β(应激前及应激后1 d、3 d和7d)、TNF-α(应激前及应激后1、7和10 d)和皮质醇浓度(应激前及应激后1、3和10 d),而提高了IL-2(应激后1、3和7d)浓度;接种S.C500提高了血清IL-1p(应激后1、7和10d)、TNF-a(应激后1、3、7和10d)和皮质醇(应激后1、3和10d)浓度,却降低了IL-2(应激后1、3、7和10 d)浓度。添加Arg和接种S.C500对血清IL-1p、TNF-α皮质醇和IL-2浓度的影响无互作效应。 7.日粮添加Arg增加了肝肾iNOS、肝精氨酸酶Ⅰ和肾和空肠精氨酸酶Ⅱ的表达,降低空肠CAT-1、2和3的表达;接种S.C500降低肝eNOS、肾和空肠精氨酸酶Ⅱ的表达,提高空肠CAT-1、2的表达。添加Arg和接种S.C500对仔猪CAT-3的表达调节具有互作效应。 8.日粮添加Arg增加了舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜、空肠黏膜、回肠黏膜、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结的pBD-1、2和3表达量;接种S.C500对pBD-1和3基因表达无显著影响,但能显著提高pBD-2在舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜、空肠黏膜、回肠黏膜、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结中的表达。添加Arg和接种S.C500的互作对肠系膜淋巴结pBD-1的影响具有互作效应,且对舌、口腔黏膜、空肠黏膜和腹股沟淋巴结中pBD-2表达的调节具有互作效应,并对肝、肌肉和空肠黏膜中pBD-3基因表达的调节具有互作效应。 以上结果表明,日粮添加Arg增加了各组织的pBD-1、2和3表达量;接种S.C500诱导的免疫应激提高pBD-2基因的表达量,免疫应激时日粮添加Arg增加了血清中IgA、IgG, IgM和IL-2,降低了血清中IL-1β、TNF-a和皮质醇浓度,进而能减轻仔猪免疫应激的影响。 试验四Arg影响pBD-1、2和3基因表达信号转导机制的初步探索 为初步揭示Arg诱导pBD-1、2和3基因表达的信号转导机制,本试验以IPEC-J2细胞系为研究模型,研究信号通路阻断剂对Arg诱导pBD-1、2和3基因mRNA表达的影响。试验选用的信号通路阻断剂有MG-132(NF-κB通路阻断剂)和PD98059(MEK-ERK通路阻断剂),共设对照组、Arg组、MG-132组、PD98059组、Arg+MG-132组和Arg+PD98059组6个处理组。结果表明,MG-132极显著降低了Arg对pBD-2基因mRNA表达的上调作用,而PD98059极显著的降低了Arg对pBD-1和3基因mRNA表达的上调作用。结果表明,NF-κB通路可能是Arg调控pBD-2基因表达的信号转导通路之一;MEK-ERK通路可能是Arg调控pBD-1和3基因的表达的信号通路之一。 综上所述,藏猪和DLY猪体内pBD的表达水平存在明显的品种差异和组织特异性;细胞试验模型和动物试验模型均表明,Arg能够诱导pBD-1、2和3基因的表达,而这一过程可能受到机体内调节基因表达相关信号通路(NF-κB通路或MEK-ERK通路)的调节。


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