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滇重楼鲨烯合酶和环阿屯醇合酶的基因克隆与序列分析

王进波  
【摘要】:甾醇皂苷是植物中的一大类天然次生代谢产物,由异戊二烯代谢途径合成,对人体有着广泛的生理活性和药理作用。重楼(Rhizoma Paridis)是我国一味传统中药,其富含的甾醇皂苷是主要生物活性成分,但其生物合成途径相关研究较为薄弱,限制了利用生物工程技术在该材料中的应用。本研究采用同源克隆和RACE技术,从药用品种滇重楼(Paris polyphylla Smith var. yunnanensis)中克隆了鲨烯合酶基因(PpSQS)和环阿屯醇合酶基因(PpCAS)的cDNA序列,以期为其基因功能、分子进化、重楼甾醇皂苷的生物合成调控提供一定的理论基础。主要取得以下研究结果: 1.以新鲜滇重楼叶片为材料,提取总RNA。根据其它植物中SQS基因和CAS基因保守序列分别设计兼并引物,采用RT-PCR技术分别扩增出330bp和869bp的片段。核苷酸序列和氨基酸序列比对结果表明,获得PpSQS和PpCAS的保守片段。 2.采用RACE技术,扩增滇重楼PpSQS和PpCAS基因cDNA的5’-末端和3’-末端。经拼接后的测序结果表明,获得PpSQS的cDNA全长1489bp,5'-UTR为24bp,3'-UTR为262bp,含有一个1212bp的ORF;获得PpCAS的cDNA全长2763bp,5'-UTR为244bp,3'-UTR为208bp,含有一个2283bp的ORF。经Blast比对表明,该序列分别为滇重楼PpSQS基因和PpCAS基因的全长cDNA。 3. PpSQS的ORF可编码403个氨基酸的蛋白,预测分子量为46.37KDa, pI6.39。 PpSQS与GenBank中其它植物SQS氨基酸序列同源性在42-85%之间,在系统发育中更接近于单子叶植物。二级结构和三维建模结果表明,PpSQS的氨基酸富含a-螺旋,且在C-端300个氨基酸处有1个跨膜区域,在C-末端含有1个疏水区;PpSQS的三维结构具有SQS典型的两个由α-螺旋构成的催化活性中心口袋和保守的氨基酸残基位点。 4. PpCAS的ORF可编码760个氨基酸的蛋白,预测分子量为86.9KDa, pI6.54。 PpCAS与GenBank中其他植物CAS氨基酸序列的同源性在60-83%之间,系统发育树中归于单子叶植物纲的Cluster Ⅱ。二级结构和三维建模结果表明,PpCAS含有由a-螺旋组成的典型CAS基因结构域,活性口袋和催化位点。


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