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小麦白粉菌cDNA文库构建、ESTs分析及Avr_(a-10)-like基因的表达研究

李欣龙  
【摘要】:小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的小麦白粉病是世界上小麦主产区的主要病害之一,选育抗病品种是目前防治白粉病最为有效的措施。但是因为小麦白粉菌毒性变异快,新选育获得的抗病品种的抗性会很快的丧失,严重威胁到小麦生产的产量和质量。许多科学家从群体遗传学和病害流行学方面对禾谷类白粉菌进行了细致的研究,然而由于白粉菌是严格的活体专性寄生菌,无法实现人工纯培养,因此难以建立白粉菌的分子遗传操作体系,以致到今天关于其致病机理和遗传变异的研究还处于起步阶段。近年来随着分子生物技术的迅速发展,推动了像白粉菌等以前难以深入研究的专性寄生病原真菌以及与寄主互作过程中功能基因的鉴定和分析。 本研究采用了Clontech公司的SMART技术,构建了小麦白粉菌孢子的均一化cDNA文库,从中获得了大量的高质量EST序列,并进行了基因注释、功能分类,同时结合相对定量RT-PCR,研究了小麦白粉菌Avra-10-like基因在侵染各个时期的表达特征。通过研究获得了以下主要结果: 1、采用Clontech公司的SMART技术构建了小麦白粉菌菌株E17分生孢子的均一化cDNA文库。文库的独立克隆数为3.6×106个,原始滴度为1.5×106pfu/ml,重组率为98%,平均插入片段为1.5kbp,全长率为54.86%。小麦白粉菌的文库符合质量的标准要求。 2、从小麦白粉菌的cDNA文库中随机挑选了8000个单独克隆,从5’端单向一轮测序,总共获得6043条高质量的EST序列,测序的成功率为81%。6043条高质量的EST序列经过质量控制和聚类拼接后获得1028个contigs和2787个singletons,共3815个一致序列(unigenes),其中2640个能够在非冗余蛋白数据库中找到最佳匹配的序列,具有明确功能的1323个,与已知序列同源但是功能未知的一致序列有1317个,249个一致序列没有注释信息,可能是一些新的基因。1734个一致序列与结构域、功能位点、跨膜区域、二硫键位置、翻译后修饰、突变体等有详细注释的蛋白实现了最佳匹配。2546个一致序列与代谢上的酶实现了最佳匹配,具体分布在904条代谢途径上。3625个一致序列实现了开放阅读框的预测,大小分布在102-1872bp之间,GC含量在41.75-51.1%之间,平均为45.0%。可以找到最佳匹配序列的一致序列在蛋白质水平上大约71.26%与真菌蛋白具有同源性,10.34%与昆虫具有同源性,6.90%与植物具有同源性。功能已知的基因按功能分为蛋白质合成、代谢、RNA合成、细胞结构与生长、细胞信号与交流、细胞分裂与染色体结构、细胞防御、转座八大类。 3、获得了9个一致序列与已经报道的致病相关基因具有相似性,分别为Bgt3565、Bgt555、Bgt3445、Bgt1501、Bgt3733、Bgt2050、Bgt2418、Bgt2485、 Bgt3455。这些基因主要参与细胞的信号交流和作为致病的效应子,具有非常高的研究价值,有望为小麦白粉菌的致病机制的研究提供有用的资源及基础。 4、采用相对定量RT-PCR方法研究了Avra-10-like基因在小麦白粉菌孢子时期、初生芽管时期、次生芽管时期、附着胞时期、吸器时期、次生菌丝时期、刚产孢子却未形成孢子堆时期的表达变化,结果显示在各个时期均有表达,但不同时期相对表达量差异显著(P0.05)。其中刚产孢子却未形成孢子堆时期表达量最高,附着胞时期表达量最低。孢子刚萌发时出现突然显著的上调,之后却是下调,但是在附着胞形成之后又出现显著的上调。


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