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霉菌毒素DON、ZEA及其联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡的分子机制研究

王亚超  
【摘要】:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是饲料中两种最常见的霉菌毒素。霉菌毒素不仅降低饲料营养价值,导致动物生长性能、繁殖性能下降,而且最重要和最本质的危害是破坏机体免疫系统造成免疫抑制,引起疾病高发。脾脏是霉菌毒素作用于免疫系统的主要靶器官,霉菌毒素可导致脾脏淋巴细胞凋亡,进而使机体免疫功能降低。本研究以原代培养鸡脾脏淋巴细胞为模型,研究DON、ZEA单独或联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞的凋亡损伤效应及其机理,为进一步阐明DON、ZEA及其联合免疫毒性作用的机理提供理论依据。 应用CCK-8法测定了染DON、ZEA后48h对鸡脾脏淋巴细胞的半数抑制浓度(IC5o)为30.82±10.48μg/mL和23.91±4.96μg/mL,表明DON、ZEA均能够影响鸡脾脏淋巴细胞的增殖活性。在此基础上设计DON单独染毒剂量水平为0.2μg/mL0.8μg/mL、3.2μg/mL、12.5μg/mL、50μg/mL,ZEA单独染毒剂量水平为O.lμg/mL、0.4μg/mL、1.6μg/mL、6.25μg/mL、25μg/mL,DON和ZEA联合染毒剂量为0.0125μg/mL和0.00625μg/mL、0.05μg/mL和0.025μg/mL、0.2μg/mL和0.1μg/mL、0.8μg/mL和0.4μg/mL,分别进行DON、ZEA单独或联合染毒48h对鸡脾脏淋巴细胞的毒性效应:①鸡脏脾脏淋巴细胞凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶释放率、DNA损伤及凋亡形态学的变化;②鸡脾脏淋巴细胞胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、MDA含量;③鸡脾脏淋巴细胞膜ATP酶(Ca-ATPase、Na/K-ATPase)活性、胞内pH、线粒体膜电位、活性氧、钙离子水平及其钙调蛋白(CaM)的mRNA的表达;④鸡脾脏淋巴细胞的相关凋亡基因(bcl-2、Bax、Bak-1、p53及Caspase-3等)mRNA表达(实时荧光定量PCR)及细胞培养液上清中相关的凋亡基因蛋白含量(ELISA法)。 DON、ZEA及其联合染毒48h:①各染毒组细胞凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶活性均显著或极显著高于对照组(P0.05或0.01),随毒素剂量增加,三个指标均明显升高,呈量效依赖效应,且联合染毒组各项指标均大于相应剂量单独染毒组。各染毒组脾脏淋巴细胞DNA出现片段化条带,随毒素浓度增加,DNA片段化条带越明显;细胞表现出核皱缩、呈新月形、染色质致密浓染、核碎裂等典型凋亡特征;细胞凋亡率明显大于坏死率。②与对照组比较,除DON、ZEA单独染毒最低剂量组个别指标外,染毒组SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量均显著或极显著降低(P0.05或P0.01),随毒素剂量的增加,指标均明显降低;联合染毒组4个指标均小于相应剂量单独染毒组。而MDA含量随毒素浓度升高而升高,除DON单独染毒最低剂量组、联合染毒最低剂量组与对照组差异不显著,其余各组与对照组差异极显著((P0.01);联合染毒组MDA均大于相应剂量单独染毒组。③各染毒组细胞内活性氧(ROS)、钙离子水平、CaM mRNA表达水平均随毒素剂量的升高而增加,显著或极显著高于对照组(P0.05或0.01),联合染毒组除DZ3组(DON0.2μg/mL+ZEA0.1μg/mL) CaM mRNA表达水平大于ZEA0.1μg/mL组而小于DON0.2μg/mL组外,其余均大于相应剂量单独染毒组。线粒体膜电位水平、胞内pH、Ca2+-ATPase与Na+/K+-ATPase活性,均随毒素剂量的升高而降低,显著或极显著低于对照组(P0.05或0.01);联合染毒组均小于相应剂量单独染毒组。④各染毒组随毒素剂量升高,细胞内p53、BAX、Bak-1及Caspase-3的mRNA表达升高,低剂量组与对照组差异不显著外,均显著或极显著高于对照组(P0.05或P0.01),且Bax mRNA表达水平与Bcl-2mRNA表达水平的比值亦升高,显著或极显著高于对照组(P0.05或0.01);联合染毒DZ4组(DON0.8μg/mL+ZEA0.4μg/mL) p53mRNA表达大于DON0.8μg/mL组而小于ZEA0.4μg/mL组,DZ3组(DON0.2μg/mL+ZEA0.1μg/mL) Bak-1mRNA表达均小于ZEA0.1μg/mL组和DON0.2μg/mL组;其余联合染毒组均高于相应剂量单独染毒组。各染毒组随毒素浓度升高,细胞培养上清液中p53、BAX、Bak-1及Caspase-3的含量升高,均显著或极显著高于对照组(P0.05或0.01),联合染毒组均高于相应剂量单独染毒组;而bcl-2含量却下降,极显著低于对照组(P0.01),联合染毒组均低于相应剂量单独染毒组。 结论:①DON或ZEA单独染毒及其联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞损伤、DNA片段化及细胞凋亡呈浓度依赖性,联合染毒呈亚加性协同效应;在试验设计的DON、ZEA浓度下,脾脏淋巴细胞凋亡性死亡在细胞损伤过程中发挥主导作用。②DON、ZEA导致细胞内抗氧化酶活性降低、氧化产物增加导致鸡脾脏淋巴细胞氧化损伤是细胞凋亡性死亡的重要机制。③DON或ZEA单独染毒及其联合染毒导致鸡脾脏淋巴细胞线粒体膜电位降低,细胞内酸化,离子平衡失调等一系列细胞内环境稳态失衡促进了细胞凋亡。④DON或ZEA单独染毒及其联合染毒上调Bcl-2基因家族基因(Bax、 Bak-1)、抑制Bcl-2基因家族基因中bcl-2基因表达;上调p53基因和Caspase-3基因表达,激活p53和Caspase通路而诱导细胞凋亡增加;两毒素联合表现出亚加性效应。


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