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海洋中稻瘟病拮抗菌的分离、发酵优化及其活性成分分析

靳西彪  
【摘要】:稻瘟病是造成水稻减产最严重的病害之一,目前主要以化学防治为主。由于化学防治的局限性及对环境的破坏性,这种防治手段已造成越来越严重的社会问题。以利用微生物天然次生代谢产物为主的生物防控,不仅能有效防治作物病害,而且对环境不会造成污染,符合现代农业发展的需求。 海洋是一个巨大的生物资源库,但由于其特殊的生存环境,大部分海洋生物资源尚未被开发。随着生物技术的发展;越来越多的海洋微生物被开发、利用,它们的次生代谢产物为生物防控提供了新的策略。 本研究从海洋样品中分离、鉴定出对稻瘟菌有拮抗作用的细菌,通过发酵优化,提高了活性物质代谢产率;采用各种色谱法对活性物质进行了分离纯化,并测定活性物质的分子量,为后续开发、利用提供了实验依据。本研究的结果有以下几点: 1.拮抗菌株的分离、鉴定 从海样样品中分离到了13株对水稻稻瘟菌有明显抑制活性的菌株,通过16SrDNA单引物序比对,发现有ZJ387与Cobetia marina有最高的同源性(99.351%),其他12株菌株与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)及嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)有高度同源性,推测这几种菌株可能为同一种菌。我们选择抑菌活性更强的ZJ186作为目标菌株,用于后续研究。 通过形态学观察、生理生化指标测定以及16S rDNA系统进化树分析,确定ZJ186属于高地芽孢杆菌。 本文首次从海洋材料中分离到了高地芽孢杆菌,并首次报道了高地芽孢杆菌对稻瘟菌有拮抗作用。 2.拮抗菌株ZJ186的发酵优化 通过发酵培养基的筛选实验,选用Landy作为发酵基础培养基进行优化。经单因素优化试验,确定以最佳碳源糖蜜10g/L、20g/L、30g/L,最佳氮源菜籽粉2.5g/L5g/L、10g/L, NaCl0.75g/L、1.5g/L、3g/L, MgSO40.5g/L,1g/L、2g/L,发酵时间36h、48h、72h,温度28℃、32℃、37℃,初始pH值5、6、7,接种量1%、2%、4%,装液量10%、30%、50%等9种因素各三个水平采用L27313正交表进行优化。 经显著性检验,糖蜜(碳源)、NaCl、发酵时间、初始ph值及装液量的F值均达极显著水平,菜籽粉(氮源)、MgSO4和温度的F值达到显著水平,而接种量F值不显著。最优发酵组合为:A2B2C3D2E2F1G2I2。 发酵优化后的发酵液滤液相对抑菌率为67.54%,较优化之前的54.1%,优化效率提高了24.83%,较阳性对照三环唑抑菌活性(21.64%)提高了212.06%。 通过发酵优化实验,我们提高了稻瘟菌拮抗菌株ZJ186产生抑菌活性物质的能力,为该菌株的进一步开发奠定了研究基础。 3.抗菌活性物质的分离纯化及活性成分分析 通过抗菌图谱检测,高地芽孢杆菌ZJ186对测试的不同生理小种的稻瘟菌及水稻纹枯病原菌有拮抗作用,对测试的青霉素类、大环内脂类等抗生素敏感,对杆菌肽、复达欣、环丙氟呱酸三种抗生素有耐药性。 田间检测发现,菌株ZJ186的发酵液处理后的植株感病指数为12%,显著低于阴性对照,能较好的防治稻瘟病。通过孢子抑制实验进一步证明,拮抗菌ZJ186的发酵液可以抑制孢子萌芽达6h,而阳性对照三环唑处理后的孢子在2h就已经开始产生萌芽。发酵液处理后的孢子芽管长度极显著低于同时期阴性和阳性对照。结果表明,菌株ZJ186的发酵液能有效的防治稻瘟病。 菌株ZJ186属于分泌型,可通过发酵获得活性物质。该菌株具有较高的遗传稳定性,在连续传代10次后,发酵液活性保持不变。ZJ186在Landy发酵培养基中抑菌活性与菌体生长状况呈极显著正相关(p0.01),其最佳发酵时间为72h至80h。 通过对活性物质的理化性质研究,发现活性物质具有耐高温、耐酸性,但其在强碱性条件下容易失活。粗提物最小抑菌浓度为100ug/ml。 根据活性物质极性较大的特点,采用MCI反相色谱、Sephadex LH-20及高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化,经质谱检测,其分子量为270.2。经分子量数据库的检索比对的结果推测,活性物质可能为一种新的抗生素。


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