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IGF-1对鸭胚肌肉发育影响及其分子机理研究

刘贺贺  
【摘要】:鸟类肌纤维发育与其他脊椎动物一样,其数量在胚胎期就基本固定下来,在动物出生后不再增加,出生以后肌肉产量的增加主要缘于肌纤维的增粗和变长。针对禽类卵生的生理特点,通过卵内注射营养物质到禽蛋气室、蛋白或胚胎中均可以影响禽类机体的生理、代谢以及发育等。很多外界因素对鸟类胚胎肌肉发育的影响都是通过影响IGF-1的表达而介导的。为进一步探究IGF-1对鸭胚胎肌肉发育的影响及其分子机理,本研究采用卵内注射的方法将IGF-1注射到孵化的鸭蛋蛋白中,依次研究卵内注射IGF-1对鸭成肌细胞增殖、卫星细胞激活、肌蛋白代谢相关基因表达等的影响,以及在细胞水平上分析IGF-1实现上述作用的分子机制。具体研究内容:(1)通过荧光定量PCR的方法检测主要肌源性基因在肌肉发育过程中的发育性表达模式,初步了解鸭胚胎期肌肉发育特点及与肌源性基因表达模式之间的关系;(2)通过卵内注射IGF-1到鸭蛋蛋白后,采用免疫荧光技术检测IGF-1对鸭胚胎肌肉不同发育阶段成肌细胞增殖、卫星细胞激活的影响,并运用荧光定量PCR技术检测IGF-1对肌肉发育和蛋白代谢相关基因表达的影响;(3)通过分离和培养鸭原代成肌细胞,采用细胞信号通路阻断剂Ly929402和RAPA分别阻断P13K和mTOR后,研究IGF-1对FST基因以及其他通路关键基因表达的影响,分析FST在IGF-1诱导成肌细胞增殖过程中的作用;(4)通过原核表达获得鸭重组FST蛋白,研究其对肌肉发育以及肌肉发育相关基因表达的影响。 主要结果和结论如下: (1)MRFs基因家族各个成员在鸭次级肌肉发育过程中呈规律性表达,其中MyoD和Myf5、MyoG与MRF4的表达模式分别一致,在肌肉发育过程分别执行差异的功能。另外,MRFs在鸭胸肌和腿肌中的表达模式存在差异,说明MRFs的表达特性还与肌纤维类型有关。在鸭胚次级肌肉发育过程中,IGF-1与FST的表达模式整体呈现一致性的变化,提示IGF-1与FST的功能存在一定关系,可能协同调控了肌肉发育过程。 (2)卵内注射IGF-1可以影响鸭胚体重、肌肉重、肌纤维各种参数包括肌纤维直径、密度等;同时,卵内注射IGF-1还诱导了成肌细胞的增殖;IGF-1处理组胸肌和腿肌中MyoG和MRF4的表达水平都显著高于对照组,表明卵内注射IGF-1可以调控MyoG和MRF4的表达,进而诱导成肌细胞的分化,进一步诱导肌纤维肥大和增生并最终影响肌肉发育。另外,卵内注射IGF-1对鸭胸肌和腿肌的影响程度存在差异,推测与禽类胚胎期腿肌肌肉发育本身较快和禽类胸、腿肌的肌纤维组成特点有关。 (3)卵内注射IGF-1能诱导出壳前后鸭胚的生长发育,尤其可以促进肌纤维的肥大和发育,主要依赖于IGF-1对卫星细胞激活的影响。IGF-1能够调控MyoD和Myf5的表达,进而诱导卫星细胞激活;激活的卫星细胞增殖后,融合进入肌纤维导致肌纤维肥大、增生而促进肌肉的发育。另外,IGF-1对鸭胚胸肌和腿肌发育影响程度是不同的,IGF-1对鸭腿肌中卫星细胞激活和增殖的影响明显要高于胸肌,表明IGF-1可能对慢肌类型肌纤维影响更明显。 (4)卵内注射IGF-1能够上调鸭胚肌肉组织EIEF基因的表达,抑制蛋白降解过程相关基因MurF和MAFbx的表达,即卵内注射IGF-1可以通过诱导蛋白转录,抑制蛋白降解的过程实现对肌肉发育的调控。卵内注射IGF-1可以调控鸭肌蛋白代谢,进而影响肌肉的发育。在鸭胚卵内注射IGF-1后,细胞内质网蛋白质量调控体系一定程度上参与了调控作用,但具体机制还不清楚。 (5)个体水平上,卵内注射IGF-1能上调FST基因表达,并且FST的表达以IGF-1浓度依赖的方式。细胞水平上,培养基中添加IGF-1也可以诱导FST的表达,但当采用Ly929402抑制PI3K后,而下游基因包括IGF-1R、 EIEF, mTOR、 MAFbx、 MurF、 MyoG、 MRF4、 ACVR1、 ACVR2等的表达都不同程度上发生了变化,而FST的表达变化不显著;当IGF-1处理过程中同时采用RAPA抑制mTOR后,FST的表达水平显著上调,上下游基因的表达也不同程度上发生了变化,表明IGF-1可以通过诱导FST的表达进而实现IGF-1对TGFβ信号通路的抑制作用,以上过程可能与P13K路径无关。一些未知路径可能参与了IGF-1对mTOR的调控,进而实现IGF-1对FST表达的调控。FST是IGF-1通路和TGFP信号通路之间相互作用的又一关键因子,可能是IGF-1实现对TGFβ通路中MSTN抑制作用的关键因子。 (6)本研究获得了鸭FST重组蛋白,并且该蛋白具有诱导鸭成肌细胞增生的生物活性;还发现卵内注射鸭FST重组蛋白对鸭胚肌肉发育不明显,但却能抑制MSTN的表达,以及上调MyoD、 Myf5、 Pax7等基因的表达水平,表明鸭FST重组蛋白在鸭胚胎时期肌肉发育中具有较重要的作用。


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