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慈竹CBF1基因克隆及其耐寒性研究

蒋瑶  
【摘要】:CBF/DREB1是一个布冷驯化过程中起关键作用的转录因了家族,该转录因子操控很多抗逆相关基因的表达,是抗寒相关基因启动表达的总开关。本研究通过RACE技术,克隆了丛生经济竹种之一慈竹的CBF1基因全长序列克隆,同时构建慈竹CBF1基因的过表达载体和RNA干涉载体,并通过农杆菌介导法转入模式植物烟草,研究慈竹CBF1基因功能,为进一步研究慈竹耐寒机理奠定基础。主要研究结果如下: 1.以慈竹叶片为材料,根据已报道的CBF1(CRT-Binding factor1)基因的cDNA序列设计简并引物,通过TD-PCR技术,得到1条新的CBF1基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5'RACE和3'RACE得到一条新的CBF1基因全长序列,命名为NaCBF1,并提交Genbank注册,注册号为JN896707.生物信息学分析结果表明,该序列编码区(coding sequence, CDS)全长为663bp,编码221个氨基酸,其序列中存在PKRRAGRTKFKETRHP和LNFADS两大CBF1氨基酸保守域。 2.成功构建RNAi干扰载体pBI121-NaCBF1-RNAi和NaCBF1基因过表达载体pBI121-NaCBFl,并将后者通过叶盘法进行烟草转化研究。通过预培养、侵染、筛选、生根等步骤得到大量转化幼苗。常规PCR检测获得了含有NaCBF1基因的转基因烟草阳性植株,初步证明该表达载体已导入烟草叶片基因组中;半定量RT-PCR检测结果表明,NaCBF1基因在转基因烟草(如OE1、OE2和OE3株系)中的表达量与未转化的对照相比,明显增加。 3.为检测NaCBF1基因过表达对转基因烟草耐寒性影响,本研究对野生型烟草(WT)和T2代过表达NaCBF1转基因烟草(OE1、OE2和OE3),在不同温度胁迫(25℃、15℃、4℃、0℃和-2℃)下处理0h、3h、6h、12h和24h,测定其叶绿素荧光参数,及其逆境响应相关生理指标。结果表明,随着胁迫温度的降低,与野生型烟草相比,过表达NaCBF1转基因烟草的叶绿素荧光参数除NPQ值增大外,Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR, qP、和Fv/Fo值都减小,降幅缓慢,表明NaCBF1过表达的转基因烟草叶片的光系统受损较小,PSH反应中心丌放度增大,光合电子传递活性增强,对逆境胁迫具有更强的抗性。不同温度胁迫下,转基因烟草的MDA和RC相对较低,抗氧化酶系统(SOD、POD、CAT)均保持较高的活性,同时渗透保护物质脯氨酸、可溶性糖含量也明显担高,表明转基因烟草电解质外渗量相对较小,膜脂过氧化程度相对较低,活性氧的清除能力提高,有利于维护细胞膜结构和功能,从而缓解温度胁迫的伤害,可见NaCBF1在烟草中过表达可增加转基因烟草的耐寒性。 4.相关性分析表明,过表达NaCBF1转基因烟草的POD活性与各叶绿素荧光参数呈显著或极显著的正相关,表明其在低温或冷冻胁迫下仍能保持较高光合能力,可能与其POD活性的提高有关


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