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提高盾叶薯蓣内生真菌Dzf12中螺二萘类化合物palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的策略

李燕  
【摘要】:药用植物内生真菌是新型天然活性物质的重要来源,其在农业、医药以及食品工业等领域具有潜在的应用前景。利用内生真菌发酵来实现活性物质的工业化生产,可以提高其产量,同时对减少野生药用植物多样性的破坏具有重要意义。螺二萘化合物是一类具有抗菌、抗癌、抗细胞毒和抗寄生虫等活性的萘醌类衍生物。前期研究发现,盾叶薯蓣内生真菌Dzfl2是一株螺二萘类化合物的高产菌株,具有良好的研究价值。本文以盾叶薯蓣内生真菌Dzf12为研究对象,分别制备了其宿主植物的多糖和寡糖,研究了多糖和寡糖对内生真菌Dzf12菌丝生长和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的影响,评价了多糖的抗氧化活性,优化了水提多糖的提取制备工艺,同时探讨了表面活性剂和氧载体对内生真菌Dzf12菌丝生长和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的影响。通过实验研究,以期为宿主植物与内生真菌之间相互关系的研究提供依据,为Dzf12菌株中活性产物palmarumycins C12和C13的大规模工业化生产打下基础,为盾叶薯蓣抗氧化活性多糖和寡糖的开发利用奠定基础。本研究获得的主要结果如下: 1、通过制备盾叶薯蓣水提多糖(WEP)、碱提多糖(SEP)和酸提多糖(AEP)分别与内生真菌Dzfl2发酵共培养,发现WEP对内生真菌Dzf12的菌丝生物量和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量具有显著的促进作用。当添加400mg/L的WEP到培养了3d的培养液中,培养15d后可使palmarumycins C12和C13的产量分别达67.73和350.76mg/L,分别是对照的8.76和2.69倍。 2、研究了寡糖对内生真菌Dzf12菌丝生长及次生代谢产物的影响。通过制备水提多糖(WEP)、碱提多糖(SEP)和酸提多糖(AEP)相应的寡糖(OW, OS和OA)与内生真菌Dzfl2共培养。在三种寡糖中,发现OW对内生真菌Dzfl2的菌丝生物量和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的促进作用最显著。当在第3d添加300mg/L的OW到Dzfl2培养液中,培养15d后可使palmarumycins C12和C13的产量分别达87.96和422.28mg/L,分别是对照的9.83和3.24倍。 3、对WEP、SEP和AEP的体外抗氧化活性进行了评价。发现盾叶薯蓣水提多糖WEP在DPPH自由基清除模型、Fe3+还原模型、Fe2+螯合模型和.OH自由基清除模型均表现出较好的活性,其EC50值分别为661.19、413.86、22.36和135.27μg/mL;SEP在Fe2+螯合模型和-OH自由基清除模型中的EC50分别为885.44和412.36μg/mL;AEP在Fe2+螯合模型和-OH自由基清除模型中的EC50分别为771.37和600.08μg/mL。 4、对盾叶薯蓣水提多糖WEP的提取工艺过程进行了优化。通过单因素实验,确定了盾叶薯蓣水提多糖WEP得率有显著影响的取值范围,分别为:料液比1:20~1:60g:mL、提取温度60~100℃、提取时间60~180min。并且采用中心组合设计(CCD)和响应面分析方法(RSM)进一步优化了研究变量,建立了WEP得率与研究变量之间的二次多项回归方程,确定了WEP的最佳提取条件为:料水比为1:52g:mL、提取温度为94℃、提取时间为147min时,WEP得率达到最大值10.77%。 5、研究了三种不同表面活性剂和氧载体对盾叶薯蓣内生真菌Dzf12产螺二萘类化合物的影响。结果表明,Tween-20(0.2%,v/v)和液体石蜡(4%,v/v)的效果最好,palmarumycins C12和C13的总产量分别是344.25和353.89mg/L;然后对其不同添加天数进行优化,发现在第6d添加,其总产量分别是350.71和373.69mg/L。在加入液体石蜡的同时,再加入表面活性剂Tween-20,palmarumycins C12和C13的总产量为402.09mg/L,与对照(138.50mg/L)相比,产量提高了2.90倍。


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