四川地区白三叶高效根瘤菌株的初步筛选及系统发育研究

【摘要】：白三叶(Trifolium repens L.)是豆科三叶草属多年生优良饲草,具有品质高,再生性好,刈牧兼用的特点,享有我国南方“当家豆科牧草”之美誉。又因其形态优美,观赏性好,适应性和固氮能力强,在水土保持、环境绿化以及生态建设方面应用越来越广泛。面临环境恶化的严峻压力,筛选并接种豆科植物高效根瘤菌不仅可提供氮素营养,提高产量和质量,而且对减少化肥使用量,降低环境污染,具有良好的经济效益、社会效益和生态效益。本研究从四川雅安、康定、西昌等地采集到的80余份白三叶根瘤样品中分离与纯化得到供试菌株,通过水培和砂培试验初步筛选出与白三叶共生匹配的高效根瘤菌菌株,同时采用16S rDNA PCR-RFLP选取代表菌株,对菌株16S rDNA、持家基因(recA、atpD、glnll)及共生基因(nodC和nifH)的序列测定分析进行遗传多样性和系统发育研究,以进一步确定所选高效菌株的分类地位,主要结果如下：1.不同采集地白三叶的根瘤呈现有椭圆形、球形、圆锥状和葫芦状等多种形态,外观为粉红色。从根瘤中所分离的根瘤菌菌株,在含刚果红的YMA平板上的菌落均为圆形,不吸色而呈乳白色,粘稠状,透明或半透明,边缘整齐,表面稍凸起而富有光泽,革兰氏染色为阴性,在牛肉膏蛋白胨培养液中均不生长(LS1105除外),符合根瘤菌典型的个体形态和菌落特征,采用平板划线分离法共分离获得72株菌株。2.水培试验结果表明,除了LS1105、XC1102、XC1103、XC1112、KD1109共5株菌株外,其余67株供试菌株接种的白三叶植株全部结瘤,且结瘤数、株高、植株鲜重和干重显著高于CK和未结瘤的植株。其中,以KD1104、KD1111、KD1117、 LD1102、YA1105、YA1103、YA1121、XC1108、XC1109、XC1110、CD1105、LS1104共12株菌株接种效果最为明显,植株生长高大健壮,充满活力,具有很强筛选出高效菌株的潜力,可用于进一步的砂培试验。3.以上12株菌株的砂培试验结果表明,与未接种的相比,接种根瘤菌菌株的白三叶植株高大,长势茂盛,叶片宽大且浓绿,所有供试菌株都全部结瘤。其中,接种菌株YA1121和CD1105,显著提高了植株的结瘤数、株高、鲜重、干重、叶绿素含量和全氮含量,比未接种的分别增加了90.89%、103.09%、187.98%、51.27%、40.92%和68.23%、86.32%、114.38%、54.70%、33.22%,为初步筛选出的白三叶根瘤菌高效菌株。4.16S rDNA PCR-RFLP分析中所有供试菌株产生了4种酶切图谱类型,表现出较为丰富的遗传多样性。其中,有类型Ⅰ (AAAA) 69株菌,占据供试菌株的95.8%,其余Ⅱ (BBBB)、Ⅲ(CACA), Ⅳ(DCDC)三种类型各有1株菌,分别为LS1101、LS1105和KD1107,仅占4.2%,表现出了一定的遗传变异和地域差异。16S rDNA序列测定分析结果表明,全部供试菌株分别归属于根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(.Agrobacterium)2个系统分支。除了LS1105与Ag. tumefaciens NCPPB 2437T的亲缘关系最近,相似性达到99.5%外,绝大部分菌株与R.leguminosarum bv. trifolii ATCC 14480T序列相似性在99.7%以上。5.持家基因(recA、atpD、glnII)的系统发育分析结果与16S rDNA系统发育分析结果基本一致,供试菌株也归属于根瘤菌属和土壤杆菌属2个系统分支。LS1105亦与Ag. tumefaciens NCPPB 2437T聚在一起,它们之间的相似性为92.4%,其余菌株与R.leguminosarum bv. trifolii ATCC 14480T的序列关系最近,相似性在93.4%～95.0%之间。从属于根瘤菌属的菌株可用PCR扩增出nodC和nifH共生基因片段,但从属于土壤杆菌属的菌株LS1105中则扩增不出这两个基因。从两者构建的系统发育树来看,除了LS1105以外,其余的菌株均以R.leguminosarum bv. trifolii ATCC 14480T和R.leguminosarum bv. trifolii 9.2k(R2-1)的相似性为95.6%-97.5%之间,可以确定其为白三叶根瘤菌。综合菌株筛选和系统发育研究的结果,菌株YA1121和CD1105为初步筛选出的高效白三叶根瘤菌,可应用于后续的田间试验作更进一步的研究。并通过不同采样地点菌株之间的比较,发现白三叶与根瘤菌的共生关系因地理分布不同而具有多样性,对于丰富白三叶根瘤菌资源及其开发利用具有重要意义。