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减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究

黄凌远  
【摘要】:罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的暴发给罗非鱼养殖业造成了巨大的损失。本课题,以2009年,在海南暴发的罗非鱼无乳链球菌病为背景开展了针对该病的口服核酸疫苗的研究。我们将编码Sip蛋白的sip基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒pVAX1-sip,并将该重组质粒电转化到减毒沙门氏菌SL7207,成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服核酸疫苗。评价了疫苗的安全性、稳定性、在罗非鱼的组织分布以及口服免疫效果。具体内容包括:1.罗非鱼无乳链球菌sip基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达以罗非鱼源无乳链球菌的强毒力株(JF423941)的DNA为模板,PCR扩增了sip基因,并T-克隆,质粒测序分析,sip基因长度为1002bp,编码333个氨基酸(KJ398146.1)。在T-克隆重组质粒的基础上,以pVAX1为载体,成功构建了真核表达重组质粒。通过脂质体转染,重组质粒成功转染EPC细胞,利用间接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法,证明了Sip蛋白在EPC细胞内的表达和表达蛋白免疫原性。2.重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定本章采用电转化技术,成功将核酸疫苗质粒导入了减毒沙门氏菌SL7207。对构建的重组减毒沙门氏菌进行了生物学特性分析,结果表明将外源基因导入减毒沙门氏菌载体菌株后,重组减毒沙门氏菌的生长特性未发生明显变化,与原始株趋于一致。在体外,在含抗生素培养环境下SL7207-pVAX1和SL7207-pVAX1-sip两株重组菌的质粒比较稳定,传代50代后,质粒稳定性仍然在90%以上;在不含抗生素培养环境下,重组沙门氏菌中的质粒稳定性有所下降,随着传代数的增加,可能存在质粒的丢失,但在35代内,稳定性仍然能够在80%以上,显示了较好的稳定性。体内稳定性试验表明减毒沙门氏菌能够稳定携带外源基因有效侵染到罗非鱼的各组织器官,为核酸疫苗发挥效果提供了前提保障,同时重组菌在免疫接种后28d,能够完全从机体消除,也表明了该重组菌具有较好的生物安全性。本章还考察了烘干和储存温度对口服免疫饲料中重组菌的影响,结果提示低温烘干和低温储存可以降低重组菌的损失率,同时建议口服免疫饲料尽量现配现用,以保证最佳免疫效果。3.核酸疫苗的安全性研究本章将不同浓度的重组菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接种罗非鱼,统计死亡率,得该重组菌对罗非鱼的半数致死量(LD50)为1.7×1011cfu/尾,该LD50值极高,表明对罗非鱼的毒力极弱。以灌胃途径免疫接种,在不高于1.25×1010cfu/尾灌服剂量范围内,罗非鱼不会出现死亡等异常症状,相对安全。以109cfu/mL,0.5mL/尾,灌胃接种罗非鱼,整个试验期间罗非鱼未发生死亡等异常,组织病理学观察表明,对照组和免疫组的各个组织脏器均相对正常,该剂量下免疫接种不会对罗非鱼造成病理损伤,是安全的。基因整合试验表明,在检测敏感度为102拷贝数下,重组质粒不会与罗非鱼发生染色体整合。综上,通过重组菌毒力试验,重组菌对罗非鱼的病理损伤评价和外源基因与宿主基因整合性三方面考察,均证实该疫苗对罗非鱼是安全的。4.核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达本章对核酸质粒和表达的Sip蛋白进行了组织分布考察,结果表明,通过PCR检测,证明核酸质粒可分布于罗非鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏;利用免疫组化方法,检测到表达的蛋白可分布于脾脏和肝脏。核酸质粒或表达的蛋白在组织内存留的时间与免疫接种次数呈正相关。试验结果表明,减毒沙门氏菌能够作为核酸疫苗的运载体,将sip基因携带并转移到靶组织,同时核酸疫苗质粒能够在罗非鱼体内进行有效的表达,为后期免疫试验奠定了基础。5.重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察罗非鱼经灌胃和投喂免疫饲料两种途径,分不同免疫次数进行免疫接种。考察了免疫后罗非鱼的血清总蛋白含量、血清总超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清补体C3含量、血清抗菌活性这些非特异性免疫指标以及体液免疫指标抗体效价和细胞免疫指标IL-1β、TNF-α细胞因子转录水平。综合评估了本课题研究的核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果。结果表明,灌胃和投喂免疫饲料两种免疫方式,均能够有效的诱导免疫应答反应。使罗非鱼获得抗无乳链球菌感染的能力。灌胃组最高免疫保护率为57%,拌料组最高免疫保护率可达63%。基于前期的安全性研究结果,最终推荐免疫程序为:108cfu/g拌料免疫接种,进行三个免疫程序,每次间隔7d,每次连续口服7d,每次每尾按鱼体重1%投喂免疫饲料。


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