玉米CMS-S型育性恢复突变体rfl~*04-229和rfl~*04-230候选基因的克隆及转录表达与GMS突变体K305ms的初步鉴定

【摘要】：玉米(ZeamaysL.)是主要的粮食作物之一,杂种优势利用是提高玉米产量的的一个有效途径。植株雄性不育(MS)现象的发生虽然不利于植物后代的延续,但是MS现象为更广泛的利用杂种优势和探索花粉发育以及细胞核和细胞质互作机理提供了非常重要的研究材料。因此,本研究以Mutator(Mu)转座子插入创制获得的玉米S型细胞质雄性不育(CMS-S)育性恢复突变体rfl*04-229和rfl*04-230为材料,利用Mu-Illumina测序克隆其育性恢复候选基因,并对突变材料进行表型、基因型以及基因转录水平的鉴定与分析,推测其育性恢复机理。同时,本研究还以钻60γ射线辐射诱变获得的玉米GMS突变体K305ms为材料,对其进行表型特征、遗传特性和代谢基础分析。主要结果如下:1.玉米CMS-S型rf*04-229和rfl*04-230育性恢复突变体的花粉育性恢复效率分别为50%和70%,其自交后代均出现纯合子种子致死现象。2.利用Mu-Illumina测序和基因序列在线BLAST比对分析,结果发现在rf*04-229突变体中Mu插入第4染色体上Rp/6基因的5'UTR区,编码60S线粒体核糖体蛋白大亚基6;而在rfl*04-230突变体中Mu同时插入第3染色体上的Rpl/4和Alb3基因的5'UTR区;Rpl14基因编码50S线粒体核糖体蛋白大业基14,Alb3基因编码OXA1/ALB3/YidC膜蛋白家族中类囊体膜家族蛋白。通过与已报道的玉米CMS-S型育性恢复基因相比,由Mu插入创制的隐性突变基因rpl6、rpl14和alb3均为玉米CMS-S系统中新的育性恢复候选基因。3.以rfl*04-230突变体为母本与Mo17-N杂交,基因重组分离rpl14和alb3基因,经PCR鉴定筛选获得4株rpl14和3株alb3单突变体。用醋酸洋红染色鉴定发现rp/6和rpl14突变体花粉育性恢复率分别约为50%,alb3突变体花粉育性恢复率约为20%。4.利用RT-PCR对突变体育性恢复花粉中Rp/6和Rpl14基因进行转录水平分析,结果表明Mu插入Rp/6基因导致5'UTR区域分子量增加,表达量下降;Mu插入Rpl14基因导致其编码区表达量急剧下降至几乎无法检出的水平。推测Mu插入Rp/6和Rpl14基因可能导致线粒体核糖体蛋白亚基无法正常合成,进而造成线粒体基因编码的相关蛋白,包括线粒体编码的CMS蛋白合成受阻,从而在翻译水平上恢复花粉育性。5.玉米rpl6和rpl14和突变体均表现出纯合子种子致死现象,其姊妹交后代致死种子与正常种子分离比例均符合1:1。对授粉后16 d的致死利种子进行显微观察,结果发现rpl6和rpl14突变体致死种子的胚和胚乳发育异常,胚乳基部转运细胞层(BETL)数量减少,且BETL细胞内无法观察到或仅能观察到少量的胞间连丝存在。说明Rpl6和Rp/14基因对于BETL细胞层的发育具有重要作用,为进一步研究花粉和种子发育提供了重要材料。6.K305ms突变体与其姊妹交群体中的可育株K305F营养生长期无表型差异,但在生殖生长期K305ms雄穗无花药外露,花药干瘪无花粉,经I2/KI染色证实K305ms属于雄性完全不育类型。在不同地点、不同年份、不同季节种植,K305ms突变体姊妹交群体的育性分离比例均为1:1,而K305F自交后代不育与可育株的分离比例为1:3;K305ms突变体与4个自交系的测交后代均可育,初步判断K305ms突变体是由单隐性基因突变导致的“无花粉型”细胞核雄性不育。7.花药发育过程中,K305ms花药与颖壳中可溶性蛋白质含量和游离脯氨酸含量均不同程度低于K305F,说明花粉发育过程中K305ms的蛋白质和脯氨酸代谢出现明显异常。K305ms花药SOD与CAT酶活性显著或极显著低于K305F,但POD活性显著或极显著高于K305F,说明花粉发育过程K305ms的抗氧化系统代谢出现明显异常。