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固定化麦麸酯酶酶学性质及农残快速检测应用研究

叶麟  
【摘要】:为了保证农业生产中农作物的产量和人类食物的供给,农药的使用不可避免。其中有机磷和氨基甲酸酯类农药在我国的使用量远高于其他农药品种,由此引发的农产品中的残留问题和引发的食物中毒情况也较为突出,所以农药残留检测已成为世界各国农药管理和食品安全监管中的必要环节。由于常规实验室检测时,前处理时间长,有毒试剂消耗量大,所需的仪器设备价格昂贵,需要有专业人员操作,只能在实验室内抽样检测,并不属于快速检测技术。因此,在食品安全监管中仍然对于农药残留快速检测方法有着迫切需求。本研究将麦麸酯酶固定化,确定了麦麸酯酶的最佳固定化条件,研究了固定化酶的酶学性质,基于比色法原理研制了一种方便的农药残留速测卡,能够满足对农副产品进行快速定性检测的要求。主要研究结果如下:1.以麦麸中的植物酯酶为酶源,通过交联、吸附方法比较,选择物理吸附法将其固定于玻璃纤维素膜上,以酶活回收率为指标,探索其固定化的最佳条件。根据固定化条件的单因素试验,利用Box-Behnken设计,进一步探索了缓冲液pH值、固定化时间、固定化温度3个因素及交互作用对麦麸酯酶固定化效果的影响,确定的最佳固定化条件为:磷酸盐缓冲液pH值7.0,固定化时间4 h,固定化温度29 ℃,该条件下酶活回收率的预测值为28.21%,验证值为27.51%,证明响应面法能有效优化麦麸酯酶的固定化条件。2.对固定化后的麦麸酯酶的部分酶学性质进行了研究,结果表明:固定化麦麸酯酶的最适反应pH值为7.0,最适反应温度为40 ℃,米氏常数(Km)为6.73 mg/mL,最大反应速率(Vmax)为1.01 mg/mL·min,4 ℃贮藏对酶活损失小,温育30min对固定化麦麸酯酶的活性没有影响。经过8h的水浴处理后,固定化酶仍然保留有约90%的酶活,而游离的麦麸酯酶只保留了约70%的酶活,固定化酶在4 ℃条件下存放60 d后仍保留约60%的酶活,稳定性较游离酶有较大的提高,为后续农药残留检测奠定了理论基础。3.以农药对酶活性的抑制率为指标,确定了固定化麦麸酯酶对6种农药的灵敏度及最低检测限(LOD),且不同农药对固定化酯酶活性的抑制程度与农药浓度对数有良好的线性关系,固定化麦麸酯酶对农药乐果、甲基对硫磷、敌敌畏、西维因、叶蝉散、丁硫克百威的LOD分别是0.0091、0.009 4、0.0015、0.015、0.017、0.009 4 mg/L,检测时间通常为15 min,游离态麦麸酯酶对农药乐果、甲基对硫磷、敌敌畏、西维因、叶蝉散、丁硫克百威的LOD分别是0.35、0.453、0.006、0.043、0.035、0.014 mg/L,检测时间通常为30 min,农药对固定化酶的抑制时间更短,固定化酶对农药的检测限更低,能够单独用固定化酶膜片对农药进行检测。4.基于比色法原理,将底物、酶和显色剂固定于膜片上之后,开发设计了一种新型一次性农药残留速测卡,只需滴加样品液即可完成酶的抑制及显色,检测时间仅为15 min。其对乐果、甲基对硫磷、敌敌畏、西维因、叶蝉散、丁硫克百威的LOD分别为0.5、0.02、0.2、2、0.5、0.1 mg/L。而基于乙酰胆碱酯酶抑制的国标速测卡对乐果、敌敌畏、西维因的LOD分别是1.3、0.3、2.5 mg/L,均高于本速测卡的检测限,且操作繁琐。将制作的速测卡用于农药敌敌畏及蔬菜样品的检测结果证实,本速测卡具有操作简便、敏感性高、准确度高、成本低等优点。进一步说明本速测卡能满足大多数有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测,适合大规模样品的初筛。


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