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牛乳与母乳中低聚糖的测定方法及其不同泌乳时期变化规律的研究

陈新新  
【摘要】:哺乳动物乳汁中的低聚糖是除脂肪和乳糖外种类最为丰富的固形化合物,研究发现,在幼儿的生长发育中,乳源低聚糖具有重要的生物学意义。本研究以牛乳和母乳为研究对象,建立两种不同乳源低聚糖的测定方法,并研究了不同泌乳时期低聚糖的变化规律。1.建立了牛乳低聚糖高效液相色谱串联离子阱飞行质谱测定方法:利用固相萃取柱(Sep-Pak C18柱)和石墨化碳柱对已脱脂和除去蛋白质的牛乳进行分离纯化,用优化好的最佳衍生化试剂2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,AMAC)衍生化处理,采用高效液相色谱离子阱飞行时间质谱对牛乳低聚糖进行测定。高效液相色谱最佳流动相条件为:流动相A:乙腈,流动相B:10 mmo1/L的甲酸铵(pH 4.5)溶液;流速为0.5mL/min;柱温35 ℃,波长254 nm(采用紫外检测器);采用梯度洗脱,洗脱条件为:0~27 min,95%~85%A;27 min~29 min,85%A;29 min~31 min,85%~84%A;31 min~33 min,84%A;33 min~37 min,84%-83%A;37 min~48 min,83%~79%A;48 min~64 min,79%~73%A;64 min~66 min,73%A;66 min~74 min,73%~69%A;74 min~78 min,69%~68%A;78 min~85 min,68%~65%A。2.对牛初乳前3天,不同泌乳月份和不同胎次的牛乳低聚糖进行测定,结果表明:(1)牛初乳前3天低聚糖数量和含量随着天数的增加而减少,且牛初乳酸性低聚糖数量变化较大,而中性低聚糖数量变化不显著。初乳中酸性低聚糖含量要高于成熟乳(奶牛行业上也称为常乳)。泌乳前3天丰度最高的低聚糖均为Hex2Neu5Ac1(表示由2个六碳糖和1个N-乙酰神经氨酸组成),而成熟乳中丰度最高的低聚糖为Hex3(表示由3个六碳糖组成)。(2)牛乳低聚糖的数量从泌乳后第1个月到第7个月依次增加,泌乳第7个月时牛乳低聚糖种类达到最大值,共测得23种,自泌乳第7个月之后牛乳低聚糖的种类开始减少。酸性低聚糖和中性低聚糖在数量上的变化规律与牛乳低聚糖数量的变化规律一致。自产犊后10个泌乳月份牛乳中主要的低聚糖均为Hex2HexNAc1(表示由2个六碳糖和1个N-乙酰化糖胺组成)和Hex3。(3)1~5胎次低聚糖数量无明显变化,低聚糖含量小幅度逐步降低,且第1胎和第2胎、第4胎和第5胎低聚糖含量无显著差异(P0.05),第6胎开始低聚糖的数量和含量迅速下降。3.建立母乳中12种低聚糖超高液相色谱串联三重四级杆质谱的定性及定量方法:母乳样品脱脂除蛋白后经液相分离,通过质谱检测,梯度洗脱条件为:流动相A:10 mmol/L的甲酸铵溶液,流动相B:乙腈;流速为0.3mL/min;柱温50 ℃。0~10min,95%~75%B;10~15min,75%B;15~20min,75%~65%B;20~21min,65%~10%B;21~24min,10%B;24~25min,10~95%B;25~35min,95%B。12种母乳低聚糖标品的标准曲线在给定的浓度范围内线性良好,R2均在0.990以上,加标回收率在80%~120%之间,RSD值均小于10%。4.在含量上,不同个体母乳低聚糖差异显著,且初乳和成熟乳中低聚糖含量变化较大。5.对比牛乳和母乳低聚糖的测定方法,结果表明,超高效液相色谱串联三重四级杆质谱只能对12种母乳低聚糖进行定量分析,存在较大局限性,而高效液相色谱串联离子阱飞行时间质谱测定牛乳低聚糖的方法更具有普适性。


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