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外核心寡糖在多杀性巴氏杆菌应对应激环境及宿主感染中的作用

梁圣  
【摘要】:多杀性巴氏杆菌是一种重要的畜禽病原菌,可引起多种动物的接触性传染病,如禽霍乱。脂多糖(LPS)表达于细菌外膜,由类脂A、内核心寡糖、外核心寡糖三个部分组成,其中外核心寡糖结构具有多样性。前期研究表明外核心寡糖的完整性会影响细菌对禽类抗菌肽的抵抗力以及在鸡上的毒力。本研究进一步解析外核心寡糖结构对多杀性巴氏杆菌在极端环境下的存活及在鸭群上的致病性的影响。1多杀性巴氏杆菌缺失株的构建与鉴定通过自杀质粒介导的同源重组法缺失外核心寡糖合成相关的转移酶基因,构建三株禽源多杀性巴氏杆菌缺失株—PMZ1(Δpcg D)、PMZ2(Δgat A)、PMZ3(Δhpt E)。同时基于大肠杆菌-巴氏杆菌科穿梭质粒pMC-express,构建了相应的回补株PMZ1(pCZ54)、PMZ2(p CZ55)、PMZ3(p CZ56)。银染试验证实,各缺失株均产生了截断的LPS结构,其LPS的泳动速度均快于亲本株LPS,其中拥有最短寡糖链的PMZ3(Δhpt E)LPS的泳动速度最快。同时各回补株的LPS表型与亲本株相似。2外核心寡糖在多杀性巴氏杆菌应对应激环境中的作用抗应激环境试验表明,外核心寡糖合成相关基因的缺失显著降低了细菌对酸环境、碱环境、高渗透压、过氧化氢这四种极端环境的耐受力,表明LPS外核心寡糖的存在有助于细菌在这三种极端环境下的存活。同时巨噬细胞系RAW264.7体外感染试验证实,hptE、gatA、pcg D的缺失显著降低了细菌被巨噬细胞吞噬的数量以及抵抗巨噬细胞胞内杀伤的能力,表明LPS外核心寡糖有助于细菌被巨噬细胞吞噬以及在巨噬细胞胞内的存活。3外核心寡糖对于多杀性巴氏杆菌在宿主感染中的作用将亲本株和各缺失株经口或肌肉途径感染雏鸭,检测各菌株的体内定殖能力和毒力。结果表明,三个缺失株的体内定殖水平和毒力均显著下降,其中PMZ2(Δgat A)菌株完全减毒,高剂量攻毒后动物全部存活。肝脏、脾脏的病理结果显示,PMZ2(ΔgatA)攻毒组未发现病理损伤,PMZ1(Δpcg D)、PMZ3(Δhpt E)组存在局部的细胞肿胀、坏死等轻微的病理损伤。综上,外核心寡糖合成相关转移酶基因hptE、gatA、pcgD的缺失显著降低了多杀性巴氏杆菌对酸环境、碱环境、高渗透压、活性氧、巨噬细胞胞内杀伤这几种应激环境的抵抗力,以及细菌在鸭体内的定殖能力和其毒力,其中gatA缺失可使细菌完全减毒。


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