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猕猴桃果肉颜色差异机理及相关EST-SSR分子标记开发

涂美艳  
【摘要】:猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.)植物。我国是世界猕猴桃属植物的起源和分布中心,蕴藏着丰富的野生资源。猕猴桃因富含维生素C,被誉为“水果之王”,这正是其能在短暂的驯化栽培后快速发展成大产业的重要原因。猕猴桃果肉颜色丰富,在不同物种间及种内存在着广泛变异。但目前全球主栽品种以绿肉、黄肉和红肉品种为主。四川是世界上首个红肉猕猴桃品种选育地,随着该类型猕猴桃品种的选育与推广,更加速了世界猕猴桃产业发展进程,也吸引了更多科研人员开始从事猕猴桃果肉颜色研究。目前,果肉颜色被视为猕猴桃重要经济性状评价指标之一,受到育种者和消费者普遍关注。但迄今为止,猕猴桃果肉颜色差异的机理依然不清楚。本研究以四川猕猴桃主栽红、黄、绿肉品种为材料,分析测定了果实发育过程中色素代谢相关生理指标,明确了品种间色差的生理机制;利用转录组测序和q PCR技术,分析了黄肉和红肉代表型品种在不同发育时期不同果肉部位色素相关基因表达模式,挖掘了影响猕猴桃色素合成的主要基因;基于转录组数据分析,发掘了猕猴桃果肉颜色性状相关的EST-SSR标记及其相应基因;利用荧光标记毛细管电泳检测,采用果肉颜色相关EST-SSR引物对杂交F1代和生产性品种(系)进行了果肉颜色评价鉴定,为猕猴桃果肉颜色分子辅助育种提供了理论依据。具体研究结果如下:1、以6个不同果肉颜色猕猴桃品种为试材,研究了果实发育期果肉色泽变化规律、色素代谢相关生理生化指标变化规律及其与色素含量的相关性。结果表明:(1)红肉品种‘红阳’和‘红实2号’从花蕾期至盛花后10d左右中果皮均着红色或淡红色,内果皮着淡绿白色,盛花后55d左右两品种内果皮开始着红色,且随着果实发育,颜色不断加深;绿肉品种‘海沃德’整个发育期果肉颜色变化小;黄肉品种‘金艳’随着果实发育,果肉颜色由深绿-淡绿-淡黄-黄转变;首次发现绿肉品种‘翠玉’和黄肉品种‘金实1号’在花蕾期至盛花后3d-5d与红肉品种一样存在中果皮着红色的现象;(2)果实发育后期叶绿素降解和花青素积累是红肉品种着红色的主要因素,而果实发育后期较高的叶绿素/类胡萝卜素比值(≥6.0)是绿肉品种呈绿色的主因,红肉和黄肉品种均含有较高类胡萝卜素,但黄肉品种在果实采收前期更低的叶绿素/类胡萝卜素比值(2.6~4.4)可能是果肉呈黄色或深黄色的主因;(3)脱镁螯合酶在红肉和黄肉品种色素代谢中作用不明显,叶绿素酶、苯丙氨酸裂解酶和二氢黄酮醇还原酶是不同果肉颜色猕猴桃品种色素代谢途径中调控的关键酶;(4)‘红实2号’和‘金实1号’整个果实发育期保持着较高总酚含量,且在DPPH、ABTS以及羟基自由基清除能力上显著高于其他4个品种,这可能是其后期能呈现更显著的红色或黄色的原因;(5)各相关生理指标与色素含量的相关性分析结果显示,类黄酮含量与各品种果实色素含量成显著或极显著正相关,羟自由基清除率、Vc含量以及可滴定酸含量与多个品种果实色素含量成显著或极显著负相关,DPPH、ABTS自由基清除率以及干物质、可溶性固形物、可溶性淀粉、可溶性蛋白含量与各品种果肉色素含量相关性没有一致性。2、以红肉代表性品种‘红实2号’和黄肉代表性品种‘金实1号’为试材,利用RNA-Seq技术对其中果皮与内果皮4个不同发育时期的样本进行转录组测序(其中,‘红实2号’为盛花后0 d、28 d、75 d、157 d;‘金实1号’为盛花后0 d、44 d、81 d、189 d。均分别标注为T1、T2、T3、T4时期)。结果表明:(1)‘红实2号’得到Clean reads数目为2 192-4 331万,检测到的基因数目为24 607-29 170个。在|log2 Ratio|≥1和FDR0.05阈值下,中果皮和内果皮在T2、T3、T4时期检测到的差异基因数目分别为1 880个、4799个、7 346个和4 31个、1 493个、7 700个,KEGG富集分析显示,这些差异表达基因被富集到68个代谢途径,包括DNA复制、RNA转运、蛋白质输出、植物激素信号转导、类黄酮生物合成、花青素合成、淀粉与蔗糖的代谢等,并从中鉴定到13个花青素合成相关基因差异表达,但大部分基因的表达量随果实的发育呈现下降趋势。(2)‘金实1号’得到Clean reads数目为1 961-4295万,检测到的基因数目为24 848-27 038个。在|log2 Ratio|≥1和FDR0.05阈值下,中果皮和内果皮在T2、T3、T4时期检测到的差异基因数目分别为5 665个、6 288个、9 293个和5 010个、5 524个、9 190个。GO富集分析显示,这些差异表达基因被富集到50个类别,其中属于“生物学过程”22个、属于“细胞组分”16个、属于“分子功能”12个,并从中鉴定到14个类胡萝卜素生物合成相关基因差异表达,其中3个基因随果实发育上调表达,11个基因随果实发育下调表达。(3)通过对两品种T1、T3时期比较转录组综合分析,发现编码花青素合成的Achn385311(3GGT)基因可能是控制‘红实2号’内果皮呈红色的主效基因;‘金实1号’后期果肉呈深黄色与Achn158981(GT7)上调促进类胡萝卜素合成,Achn068721(PAO)和Achn282201(PAO)上调加速叶绿素降解,以及Achn176251(UGT71A16)上调淡化花青素呈色有关。该研究结果不仅深化了对猕猴桃果皮成色差异机理的认识,还对今后彩色猕猴桃选育种工作提供了重要理论依据。3、在前期猕猴桃果肉转录组数据的基础上,使用Primer 5.0软件开发了猕猴桃果肉颜色方面的EST-SSR引物727对。以7份不同果肉颜色的猕猴桃基因组DNA为模板,随机选择112个引物进行有效性验证。利用荧光标记毛细管电泳检测,筛选出了具有清晰的扩增产物的引物78对,有效扩增率为69.64%,58对具有多态性,多态性频率为74.36%,有23对色素、糖和抗氧化活性等方面基因的EST-SSR标记可以区分3种不同果肉颜色的样本。选择其中峰值好的15对多态性EST-SSR标记分别对63份杂交F1代群体和43份栽培品种(系)材料进行荧光检测,发现在相似系数为0.67时可以将63份杂交群体分为2个组,其中91.67%的红肉材料被聚到了第一组,而第二组中黄肉品种占97.14%,但43份栽培品种(系)在相似系数为0.75时被分为11个组,且红肉、黄肉和绿肉品种未能很好地分开。本研究丰富了猕猴桃EST-SSR标记,发掘了果肉颜色相关的多态性引物及相应基因,为利用分子标记进行杂种后代果肉颜色性状的早期鉴定提供了理论参考。


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