收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

根癌农杆菌介导稻瘟病菌基因敲除方法的优化及稻瘟病菌与水稻互作文库的构建

罗橼  
【摘要】:稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻稻瘟病,严重威胁水稻产量及质量安全,稻瘟病的防控对于保障水稻稳产及水稻品质尤为重要。稻瘟病菌基因的功能解析能为稻瘟病的防治提供理论依据,目前真菌生物学研究已进入功能基因组时代,反向遗传学方法是研究基因功能最直接简便的方法。本研究利用同源重组技术,以双荧光标签为负性筛选标记优化了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化体系,建立了稻瘟病菌高通量基因敲除系统,为稻瘟病菌基因功能研究提供了有效的技术支撑。同时,为挖掘稻瘟病菌与水稻互作过程中侵染及免疫相关的互作蛋白,针对稻瘟病菌和水稻,分别构建了侵染阶段各自的酵母双杂交cDNA文库,可运用于互作蛋白的筛选及鉴定,为明确稻瘟病菌与水稻的互作机理奠定了基础。本文的第一部分优化了根癌农杆菌介导稻瘟病菌高通量基因敲除系统,并据此遗传转化系统进行了候选基因的敲除及应用评价。第二部分构建了稻瘟病菌与水稻侵染阶段各自的酵母双杂交cDNA文库,并对两个cDNA文库进行了质量评价。1.关于根癌农杆菌介导的稻瘟病菌基因敲除方法,获得主要结果如下:(1)成功构建酵母-大肠杆菌-农杆菌三元穿梭载体pCAMBIA1300ura,并通过此载体构建了验证载体pCAMBIA1300ura-GFP-HYG。(2)用四种根癌农杆菌菌株AGL-1、C58、GV3101、LAB4404对验证载体pCAMBIA1300ura-GFP-HYG进行转化效率和转化子阳性率验证,发现AGL-1为最优转化菌株。(3)针对黑色素合成相关基因MoBUF1,构建双荧光负向筛选敲除载体,利用根癌农杆菌AGL-1对MoBUF1进行基因敲除,随机挑取144个转化菌株,有108个转化子表现为潮霉素抗性,其中78个转化菌株带有GFP或RFP标记,而30个转化菌株颜色表现为黄色并且不带任何荧光标记。对这些不带荧光的转化菌株进行PCR验证,发现其中29个均是由同源重组产生的正确ΔMobuf1敲除突变体,这说明双荧光负向筛选获得敲除突变体的效率可达26.7%。(4)利用根癌农杆菌介导真菌转化系统对多个稻瘟病菌基因进行敲除转化。对MGG_03250的敲除效率为32%,对MGG_05096的敲除效率为35%,对MGG_04972的敲除效率为28%,对MGG_00381的敲除效率为48%,对MGG_01732的敲除效率为37%,对MGG_10601的敲除效率为25%,对lnc59265的敲除效率为28%,对MGG_06375的敲除效率为66.7%。2.关于稻瘟病菌与水稻酵母双杂交cDNA文库的构建评价,获得结果如下:(1)于疏水性玻片上观察稻瘟病菌Guy11菌株的附着胞发育,发现分生孢子在4 h开始形成附着胞,8 h附着胞黑色素化,12 h分生孢子出现自噬性凋亡,24 h附着胞完全成熟。收集各阶段附着胞,提取总RNA,分离纯化mRNA,构建稻瘟病菌c DNA文库,其库容量为1.0×10~7CFU/m L,插入片段平均长度为1.5kbp,重组率为100%。(2)利用过表达绿色荧光蛋白GFP的稻瘟病菌菌株Guy11-GFPox对高抗材料地谷(Digu)与高感材料丽江新团黑谷(LTH)进行接菌侵染观察,发现在侵染0-16 h,两者之间没有差异,从侵染20 h开始,Guy11-GFPox在LTH中开始形成大量侵染菌丝,在Digu中出现极少量侵染菌丝。收集喷雾接种Guy11的Digu叶片,提取总RNA,分离纯化mRNA,构建水稻cDNA文库,其库容量为1.2×10~7CFU/mL,插入片段平均长度为1.5 kbp,重组率为100%。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前17条
1 朱继金,吴自强;基因敲除在肾素-血管紧张素系统研究中的应用[J];国外医学.心血管疾病分册;1999年02期
2 刘德培,方福德,梁植权;基因敲除[J];生理科学进展;1995年01期
3 吕飞;;浅谈“基因敲除”[J];生物学教学;2010年10期
4 秦智娟;杨晓清;张玉泉;;基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用[J];国际生殖健康/计划生育杂志;2016年01期
5 张卓鹏;;“基因敲除”专题探析[J];中学生物学;2017年07期
6 方福德;中国医学科学院实验动物研究所基因敲除中心成立并开始工作[J];中国医学科学院学报;2001年03期
7 杨晓;;“基因敲除”敲开诺奖之门[J];华夏地理;2007年11期
8 金涛,吴补领,苏凌云,高杰;远缘链球菌ftsK基因敲除菌株的构建[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2005年05期
9 李富强;吴小翠;徐丽娜;陈小梅;唐翠兰;;α7烟碱型乙酰胆碱受体基因敲除对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏炎症的影响研究[J];中国全科医学;2016年23期
10 熊鹰;基因敲除与学习、记忆:现状、问题和展望[J];生物化学与生物物理进展;1998年06期
11 ;我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型[J];饲料广角;2014年21期
12 ;我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型[J];现代畜牧兽医;2014年11期
13 ;南京研制“转基因敲除猪”[J];中国猪业;2012年03期
14 关菲菲;全雄志;朱皓;高珊;张晓娟;张连峰;;转基因和基因敲除内脂素对小鼠脂肪积累的对比研究[J];中国比较医学杂志;2012年11期
15 朱涛;段芹;李朝品;瞿涤;;一种高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立与应用[J];中国人兽共患病学报;2015年12期
16 李静琪;刘立;吕立夏;李学礼;徐磊;;利用同源重组构建人脑的酵母双杂交cDNA文库[J];同济大学学报(医学版);2006年04期
17 徐帅兵;黄兵;赵其平;董辉;朱顺海;崔晓霞;谢雨翔;唐敏;杨志远;韩红玉;;柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建[J];中国动物传染病学报;2016年06期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 黄黎珍;顾为望;;利用体细胞核移植技术生产基因敲除猪的研究[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
2 耿海洋;聂红毅;张猛;李志国;苏松坤;;基于CRISPR/Cas9的蜜蜂分子育种技术的研究[A];2000—2018中国蜂业科技前沿[C];2019年
3 周海红;张永东;王涛;郭红云;苏海翔;;基于CRISPR-Cas9系统构建CARD9基因敲除模型[A];2018年中国肿瘤标志物学术大会暨第十二届肿瘤标志物青年科学家论坛论文集[C];2018年
4 张方;施毅;辛晓峰;宋勇;赵明;李子玲;钱桂生;罗向东;;大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
5 王景;穆媛媛;黎庶;陈志瑾;熊坤;丛延广;;革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年
6 胡红;李子南;郑珊;敬海明;冯颖;尤育洲;李国君;宁钧宇;;条件性基因敲除动物的毒理学应用[A];2017年第十五届中国北方实验动物科技年会论文集[C];2017年
7 杨文博;孔佩艳;;RNA干扰在血液病研究中的应用[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
8 贺闽;宿加;许有嫔;陈金华;陈学伟;;超长链脂肪酸调控真菌致病的分子机理和作为病害靶标的用途[A];第十九届中国作物学会学术年会论文摘要集[C];2020年
9 齐中强;杜艳;于俊杰;张荣胜;俞咪娜;曹慧娟;刘永锋;;2018-2019年江苏省稻瘟病菌种群结构特征分析[A];中国植物病理学会2019年学术年会论文集[C];2019年
10 王世维;邸劼;原恺;王宁;吴波明;;我国东北稻瘟病菌无毒基因型鉴定及分析[A];绿色生态可持续发展与植物保护——中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会论文集[C];2017年
11 何月秋;周惠萍;吴毅歆;范成明;李顺德;;利用稻瘟病菌突变体鉴定水稻抗稻瘟病基因研究[A];第八届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集[C];2007年
12 林成增;周洁;郑祥梓;王琴秋;何守贵;王宗华;鲁国东;;稻瘟病菌几丁质酶家族基因功能研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
13 刘文平;王嘉琪;李彦利;王海;温嘉伟;任金平;王继春;;中国东北吉林省稻瘟病菌与水稻品种互作研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
14 杨祁云;朱小源;雷财林;王久林;;籼稻稻瘟病菌致病型单基因鉴别寄主筛选研究[A];中国植物病理学会第六届青年学术研讨会论文集——植物病理学研究进展(第五卷)[C];2003年
15 白娟;周益军;程兆榜;;我国南方稻区稻瘟病菌群体遗传结构研究[A];中国植物病理学会第六届青年学术研讨会论文集——植物病理学研究进展(第五卷)[C];2003年
16 杨俊;刘杏忠;;稻瘟病菌一个新基因的分子功能研究[A];2010年中国科学院微生物研究所博士后学术年会暨第二届博谊论坛论文摘要集[C];2011年
17 杨俊;王维香;孔令安;赵文生;薛敏峰;孙静;陈小林;王大伟;王瑞金;徐小文;鲁明;张燕;许金荣;彭友良;;稻瘟病菌中一个编码剪切因子的致病新基因的功能研究[A];中国植物病理学会2011年学术年会论文集[C];2011年
18 肖丹凤;王玲;黄世文;;光照时间对稻瘟病菌生长的影响[A];中国植物病理学会2012年学术年会论文集[C];2012年
19 张海峰;汤蔚;郑小波;张正光;;G蛋白及其下游信号途径在稻瘟病菌生长发育及致病中的作用分子机制研究[A];江苏省植物病理学会第十二次会员代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2013年
20 郑小波;张正光;;稻瘟病菌无性重组研究[A];中国植病学会西南联合学术年会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 唐志元;双基因敲除(H2-Ab1+H2-Eb1)小鼠的繁育、鉴定及其变应性鼻炎模型的研究[D];新疆医科大学;2018年
2 陈芳;Rev-erbβ相互作用分子的验证及Rev-erbβ功能研究[D];陕西师范大学;2017年
3 田慧彬;基于CRISPR/Cas9技术的奶山羊SCD1基因敲除及功能研究[D];西北农林科技大学;2019年
4 魏晓曦;C57BL/6NCrl小鼠颅面部出生后生长发育与Tscl基因敲除对小鼠颅面部生长发育的影响及机制研究[D];吉林大学;2017年
5 李小丽;线粒体丙酮酸载体对糖代谢和干性调控的影响[D];郑州大学;2018年
6 赵浩民;脂肪分化相关蛋白基因敲除抑制血管平滑肌细胞增生与分化及减少血管内膜增生的实验研究[D];吉林大学;2018年
7 戎松浩;芽孢杆菌B21中抗稻瘟病菌物质的分析及防治效果评价[D];四川农业大学;2019年
8 李德强;抗稻瘟病和稻曲病种质资源筛选与雅恢2115抗瘟基因鉴定及改造利用[D];四川农业大学;2018年
9 陈智雄;水稻地谷抗稻瘟病基因Pid4的克隆与功能分析[D];四川农业大学;2018年
10 赫娜;稻瘟病菌COS1基因对分生孢子发生的基因调控研究[D];海南大学;2018年
11 张亚玲;黑龙江省稻瘟病菌生理小种鉴定、品种抗性监测及AvrPi12定位[D];华南农业大学;2018年
12 郑文辉;Retromer复合体在稻瘟病菌和禾谷镰刀菌中的功能分析[D];福建农林大学;2014年
13 王瑞金;稻瘟病菌磷酸化蛋白与蛋白磷酸酶PPG1的靶标鉴定[D];中国农业大学;2017年
14 叶文雨;稻瘟病菌中小GTP酶激活蛋白(RhoGAPs)的功能分析[D];福建农林大学;2013年
15 刘木星;稻瘟病菌SNARE蛋白MoSyn8和MoVam7调控外泌和囊泡转运机制研究[D];南京农业大学;2017年
16 王婧臻;稻瘟病菌转录因子MoAp1和MoBzip10靶鉴定及其在致病过程中的功能分析[D];南京农业大学;2017年
17 李潇;胞吞调控蛋白MoEnd3和MoCrn在稻瘟病菌致病过程中的功能分析[D];南京农业大学;2017年
18 赵丽娜;水稻特特普持久抗稻瘟病机制的研究[D];南京大学;2019年
19 王大伟;稻瘟病菌APSES转录因子Pcg2的作用及其机理的研究[D];中国农业大学;2014年
20 李国瑞;稻瘟病菌Tctex1及其与动力蛋白中间链复合物结构解析和相互作用分析[D];中国农业大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 罗橼;根癌农杆菌介导稻瘟病菌基因敲除方法的优化及稻瘟病菌与水稻互作文库的构建[D];四川农业大学;2018年
2 王钦;代谢工程改造大肠杆菌积累L—酪氨酸与发酵条件优化[D];江南大学;2019年
3 张振;β1,3半乳糖基转移酶2基因敲除致小鼠心脏损伤的作用及机制[D];锦州医科大学;2019年
4 王红帅;利用CRISPR/Cas9构建Zfp217基因敲除细胞系和小鼠模型研究[D];华中农业大学;2017年
5 陈远;利用CRISPR-Cas9技术构建GNT1基因敲除细胞株[D];上海交通大学;2018年
6 张露允;β-1,3-半乳糖基转移酶2基因敲除对老年小鼠海马神经炎症的影响[D];锦州医科大学;2019年
7 刘晓强;肝X受体α基因敲除加重小鼠心肌梗死后心力衰竭[D];上海交通大学;2016年
8 冯铁军;SelT基因敲除对脂质代谢和胰岛素抵抗的调控作用及机制[D];华中科技大学;2019年
9 王泽昊;抗原基因敲除猪软骨作为人软骨修复材料的实验研究[D];中国人民解放军医学院;2019年
10 魏凯迪;JIP3基因敲除对NAFLD小鼠肝损伤的作用及机制研究[D];郑州大学;2019年
11 鲁国涛;利用CRISPR/Cpf1系统构建DDX21基因敲除模型及功能初步研究[D];中国农业科学院;2019年
12 丁毅;MSTN基因敲除滩羊的制备与评价[D];西北农林科技大学;2019年
13 刘曼菱;猪胎儿肾脏发育阶段的研究与Pax2基因敲除猪细胞系的制备[D];南京医科大学;2019年
14 严翼;p27~(kip1)基因敲除在雌激素缺乏引起的心肌衰老、凋亡和心功能改变中的作用[D];南京医科大学;2019年
15 陈欧;Toll样受体4基因敲除对低温治疗小鼠肺损伤影响研究[D];广西医科大学;2019年
16 王会峰;乳腺癌MCF-7细胞稳定CACYBP/SIP基因敲除株的构建及其对细胞表型的影响[D];宁夏医科大学;2017年
17 杨萍;基于碱基转换的基因敲除方法研究[D];东北师范大学;2019年
18 张翠琴;Atg7基因敲除影响三邻甲苯磷酸酯诱导的Neuro-2a细胞损伤的机制研究[D];山东大学;2019年
19 肖春虹;TLR4在小鼠肠缺血再灌注损伤中的双重作用[D];安徽医科大学;2019年
20 董维鹏;PLIN1基因敲除对3T3-L1细胞脂解的影响及机制探究[D];山西医科大学;2019年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 姬十三;“基因敲除”敲开疾病之门[N];南方周末;2007年
2 李旻本报实习记者 甘勃;基因敲除开启生命科学新纪元[N];大众科技报;2007年
3 记者 赵汉斌;高等植物多基因敲除体系研究取得进展[N];科技日报;2019年
4 记者 朱汉斌 通讯员 黄博纯;科学家建立世界首个基因敲除狗模型[N];中国科学报;2015年
5 记者 赵汉斌;癌基因敲除可完全抑制肺癌发生[N];科技日报;2018年
6 张田勘;基因敲除与基因敲低的不同作用[N];中国医药报;2016年
7 本报记者 耿挺;吃还是不吃:这是一个科学问[N];上海科技报;2017年
8 罗刚;基因敲除助推重大疾病研究[N];健康报;2005年
9 记者 张建列 通讯员 黄博纯;世界首个基因敲除狗模型建立[N];广东科技报;2015年
10 本报记者 李蕴明;全球首例基因敲除犬模型发布[N];医药经济报;2015年
11 薛培培 陈亚新;“转基因敲除猪”器官或将移植人体[N];江苏经济报;2011年
12 本报记者 项铮;广药集团成功研发世界首例基因敲除犬模型[N];科技日报;2015年
13 孙扬;基因敲除 寻找抗真菌药物新靶点[N];健康报;2008年
14 黄博纯;我科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型[N];科技日报;2014年
15 王方;稻瘟病致病源自“里应外合”[N];中国科学报;2019年
16 唐建明;稻瘟病在部分稻田严重发生[N];江苏农业科技报;2019年
17 李晨 许天颖;稻瘟病菌控制致病力新机制被揭示[N];中国科学报;2019年
18 中国青年报·中国青年网记者 李润文 通讯员 陈洁;瘟神稻瘟病菌是如何“镇压叛乱”打胜仗的[N];中国青年报;2019年
19 金凤 通讯员 许天颖;来点光照,水稻对稻瘟病菌免疫力就能提高[N];科技日报;2019年
20 记者 李晨 通讯员 陈洁;多晒太阳不易得稻瘟病机制获揭示[N];中国科学报;2019年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978