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转ZmZIP1、ZmPHD1产量相关性状基因玉米后代株系的分子特征及农艺性状分析

郑艳  
【摘要】:玉米是全世界总产量最高的粮食作物之一,也是重要的工业原料,其产量和品质对人类有着至关重要的意义。在众多作物产量与品质的影响因素中,光合作用无疑是影响最大的因素。植物叶片中叶绿素含量的多少直接影响着植物的光合能力,提高叶片光合效率能够使叶片积累更多的光合产物,增加植株生物产量进而促使经济产量增加。除此之外,很多环境因子也对作物产量起着重要的影响。如微量元素锌,与植物体内的许多生理生化反应及叶片中叶绿素合成有关。玉米是一种对锌反应相对敏感的作物。缺锌时,玉米植株体内叶绿素含量下降,光合作用减弱,严重时可使玉米产量显著下降。本实验拟用已转化锌铁转运蛋白基因(ZmZIP1)的4个转化事件和葡萄糖差向异构酶基因(ZmPHD1)的8个转化事件的转基因玉米为实验材料,分别对其进行了PCR检测、Southern blot、实时荧光定量PCR、Western blot、细胞学观察以及相关生理指标与农艺性状的测定分析,明确了ZmZIP1基因和ZmPHD1基因的遗传情况、拷贝数、m RNA转录与蛋白质翻译水平的表达情况,以及目的基因对生理指标与农艺性状的影响,为后期育出高产转基因玉米新品种提供了材料基础和理论依据。本研究得到了以下结果:1.两类转基因材料共获得12个转化事件,其中转ZmZIP1基因玉米有4个转化事件,分别命名为ZmZIP1-(1-4);转ZmPHD1基因玉米有8个转化事件,分别命名为ZmPHD1-(1-8)。通过PCR检测目的基因片段,两个转基因材料各个转化事件在T0-T4代均能检测到目的条带,且在T4代对ZmZIP1-(1-4)共1008株植株、ZmPHD1-(1-8)共1960株植株进行PCR检测,每个转化事件均获得基因不再分离的纯和株系,表明ZmZIP1基因和ZmPHD1基因可在遗传世代间稳定遗传;2.在T4代,对转ZmZIP1基因玉米4个转化事件与转ZmPHD1基因玉米8个转化事件的标记基因PMI进行Southern blot分析。ZmZIP1-(1-4)杂交结果均显示一条杂交带,且在5148 bp-21226 bp范围内条带大小不一,阴性对照(CK)无条带;ZmPHD1-(1-8)的杂交结果表明,各转化事件均呈现一条杂交带,且在3530 bp-21226 bp区间内大小不一,阴性对照(CK)无杂交带;因此,ZmZIP1基因与ZmPHD1基因均呈单拷贝形式整合到玉米基因组中,且不同转化事件插入位点不同;3.在T4代,对ZmZIP1-(1-4)四叶一心时期的叶片分别进行实时荧光定量PCR和Western blot分析,结果显示,ZmZIP1基因在各转化事件玉米叶片中的相对表达量均显著高于对照(CK),其中ZmZIP1-2和ZmZIP1-3在0.01水平极显著高于对照(CK)10倍和12倍,Western blot显示ZmZIP1-(1-4)均能翻译出目的蛋白与PMI标记蛋白,蛋白分子大小分别为48 KD与38 KD,表明,ZmZIP1基因在玉米中转录水平上高效表达且能翻译出相应蛋白;对ZmPHD1-(1-8)四叶一心时期的叶片进行实时荧光定量PCR分析,通过对比可知,各转化事件叶片中ZmPHD1基因相对表达量均显著高于对照(CK),且提高倍数达5-170倍,表明ZmPHD1基因在转基因玉米叶片中得到了非常高效的表达;4.在T4代,对ZmPHD1-(1-8)于玉米灌浆期的叶片组织进行透射电子显微镜(TEM)扫描分析,与对照(CK)相比,转ZmPHD1基因植株叶绿体内淀粉粒数目明显增加,表明ZmPHD1基因能提高植物体内淀粉含量,促进叶绿体内糖类合成与转化;5.在T4代,对ZmZIP1-(1-4)测定结果显示,各转化事件叶绿素相对含量(SPAD)高出对照(CK)3.64%—17.89%,除ZmZIP1-4外,其余三个转化事件与对照差异均达到极显著水平,表明ZmZIP1能促进玉米叶片内叶绿素相对含量的提高;6.在T4代,对ZmPHD1-(1-8)在灌浆期对穗位叶进行叶绿素相对含量(SPAD)与光合速率测定,结果显示,与对照(CK)相比,各转化事件的叶绿素相对含量(SPAD)提高了3.69%—16.73%,且在相同光照强度条件下,转ZmPHD1基因玉米的光合速率比对照(CK)高18.75%—42.44%,差异显著性分析均达到极显著差异水平,同时,经测定各转化事件植株的光饱和点均高于对照(CK),表明ZmPHD1能促进玉米叶片内叶绿素相对含量的提高,且能够通过提高光饱和点来显著提高叶片光合能力;7.在T4代,对ZmZIP1-(1-4)与ZmPHD1-(1-8)的全部植株在玉米灌浆期进行植株表型测定,主要测量性状有叶长、叶宽以及叶面积。ZmZIP1-(1-4)测定结果显示,叶面积与非转基因对照(CK)相比,各转化事件叶面积高于对照(CK)0.74%—30.99%,表明ZmZIP1基因可增加玉米生物学产量;ZmPHD1-(1-8)测定结果显示,叶面积与对照(CK)相比,进行对比分析,结果显示各转化事件叶面积高于对照(CK)9.18%—50.50%。表明ZmPHD1基因可通过增加叶面积而达到增加植株生物产量的效果;8.在T4代,对ZmZIP1-(1-4)与ZmPHD1-(1-8)的穗部性状及籽粒性状进行考察分析,主要考察性状有穗长、穗粗、穗重、穗行数及百粒重与穗粒重等。ZmZIP1-(1-4)考察结果显示,与对照(CK)相比,穗长增加4.02%—14.93%,粒厚减小13.86%—21.76%,穗粒重增加23.25%—76.95%,其他性状无规律性变化;ZmPHD1-(1-8)考察结果显示,与对照(CK)综合相比,转ZmPHD1基因玉米籽粒粒长增加6.65%—12.93%,粒宽增加1.64%—10.24%,而粒厚减小了0.08%—21.65%,穗粒重增加9.08%—140.94%。其他性状无规律性变化;结果表明,ZmZIP1基因能够通过增加穗长,从而使穗粒数增加,最终增加穗粒重,但籽粒厚度有所降低;ZmPHD1基因可以增加籽粒大小,而达到增产的效果。综上所述:ZmZIP1、ZmPHD1基因与产量性状相关,可以作为基础材料应用于高产玉米新品种的选育。


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