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减蛋综合征病毒四川株(SG9301)的分子生物学及六邻体蛋白基因的克隆和表达的研究

汪铭书  
【摘要】: 减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome virus,简称EDSV)是禽类的一种腺病毒,引起的产蛋下降综合征(Egg Drop Syndrome,简称EDS76)可导致产蛋鸡产蛋下降20-30%或以上,蛋的品质下降,是目前养鸡业的一大障碍。程安春等于1993年在国内外首次报道EDSV早期感染导致产蛋鸡开产期推迟并从四川某罗斯父母代肉种鸡场出现严重开产推迟的鸡群中分离到3株EDSV(SG9301、SG9302和SG9303)。本研究以四川本地分离的EDSV-SG9301毒株为基础材料,含病毒的鸭胚尿囊液分别采用PEG或透析袋浓缩、经差速离心沉淀以及不经任何处理,用SDS-蛋白酶K-酚/氯仿抽提出病毒DNA,经测定,DNA的浓度和纯度均无显著差异(OD_(260)/OD_(280)均达1.8以上,每毫升尿囊液中可抽提到0.5ug左右的DNA),DNA的质和量均能满足限制性核酸内切酶分析和PCR等分子生物学实验。然后对EDSV-SG9301株的一些分子生物学特性和六邻体基因进行了研究。主要包括: 1、对SG9301毒株的DNA进行了限制性核酸内切酶分析(REA),并与其他不同来源、不同宿主分离的参考株进行比较,分析了它们之间的异同和遗传变异规律。用BamHⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SmaⅠ、BglⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅤ九种限制性核酸内切酶(RE)对SG9301株的DNA进行酶切,建立了四川本地分离株的酶切图谱,并计算出了各酶切片段的分子量大小。与其它参考毒株(AV-127,H91,NE4,Qac94,JE1)的比较发现,四种RE(HindⅢ、EcoRⅠ、PstⅠ、BamHⅠ)中,六株EDSV间的片段大小和数目差异不是太大,但没有任何两株的酶切图谱完全相同。比较还发现,宿主来源相同、症状相似的毒株,其酶切图谱越相似;而宿主来源不同、症状有差异的毒株,其酶切图谱越有差异,即酶切图谱分析与它们的生物学特性是相一致,表明限制性核酸内切酶分析不仅可用于毒株间比较,而且是一种有用的流行病学工具。 2、利用PCR技术,克隆到了病毒的主要结构蛋白——六邻体的全基因。据genbank中EDSV-AV127的序列,利用Oligo软件设计一对引物,从四川本地分离的SG9301株中扩增出六邻体基因并克隆到PUC18的多克隆位点中。通过PCR、RE分析、杂交、序列分析表明,所扩增、克隆的基因片段包括了EDSV六邻体基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA在内的完整序列。六邻体多肽是腺病毒主要的结构蛋白,它与五邻体和纤维蛋白一起构成核壳,决定着病毒粒子的大小,它带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇,同时与病毒的型特异性有关,因此对EDSV的六邻体基因进行扩增、克隆和鉴定具有重要的理论和实际意义。 3、对SG9301毒株的DNA进行了部分测序,并与国内外其他参考毒株的核酸序列比较,分析了EDSV的遗传变异。分析比较EDSV的基因组结构和特性后,选取基因功能尚 未明了的PVlll基因与纤维蛋白基因间的一段核苦酸序列和编码病毒粒子主要结构蛋白一 六邻体的基因序列作为分析比较对象,对SG9301毒株的这两段区域的DNA进行了序列 ’测定和比较分析,得到以下结果和结论:①SG9301株的六邻体基因全长2733hp,共编 码gloaa,与国际标准株AV127的长度一致,在核昔酸水平上二者有4个核昔酸的差异, 只有 0.15%的变异;由核昔酸序列推导出氨基酸序列并与参考株比较,EDSV各毒株间的 六邻体在氨基酸水平上同源性也极高(98%以上),表明 EDSV的六邻体蛋白相当保守, 且EDSV各毒株间六邻体在核昔酸和氦基酸水平上的同源性与其生物学特性是一致的, 即强毒株之间的同源性高于强弱毒株之间的同源性(后者的差异是前者的6f倍X② SG9301株基因组22744-22367位的核苦酸与国际标准株AV127之间有4.69O的变异, 若把Pth基因和纤维蛋白基因的序列除掉,则Pth基因和纤维蛋白基因之间有5.84%的 变异。与各毒株之间六邻体的差异比较而言,该区域的变异大得多,分析认为,PVlll基 因和纤维蛋白基因之间只有253hp,其中没有编码容量超过60aa的ony,故E3区不可 能在此位存在(结果与AV127一致),且该区可能不是EDSV的重要功能区。 4、利用大肠杆菌作为表达系统,对EDSV的六邻体基因进行了表达,探索它们用于 兔疫预防的可行性。(1撇一一:将克隆的六邻体基因正向插入pBV220的巳人 启动子下游的Smal位点,经SDS-PAGE、Western印迹和琼扩试验,结果表明六邻体基因 在大肠杆菌中获得了表达并具有免疫学活性。(2慰昔蛋户成羡达:将克隆的六邻体基 因插入高效表达载体pQE32,经SDS干AGE、Western印迹和琼扩试验,结果表明六邻体 基因在大肠杆菌中与 6 X His一同表达为融合蛋白,不但表达水平高,且表达的融合蛋 白纯化简便,并具有免疫学活性。这些研究为EDS76基因工程茵的研究提供了基础。 5、建立了光生物素标记的六邻体探针检测病毒的核酸探针分子检测方法。以从四川 本地分离的SG9301株中扩增出并克隆到PUC18的多克隆位点中的?


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