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玉米几个重要基因的克隆和改良直链淀粉的转基因研究

陈荣军  
【摘要】: 玉米是主要的粮食和饲料作物,在世界和我国农业生产上均具有重要的作用。我国在玉米的常远规育种方面已经取得了长足的进步。随着植物分子生物学技术及转基因技术的发展,利用生物技术和转基因技术来提高玉米的抗逆性及改良玉米的品质方面取得了很大的成功。利用转基因技术来提高玉米的抗逆性及改良玉米品质的前提条件是相关基因的分离和克隆。本研究以抗大斑病玉米自交系48-2为材料,利用mRNA差异显示技术从玉米中克隆与玉米抗病相关的基因。同时利用GenBank中已有的序列设计引物。用RT-PCR方法克隆与淀粉合成相关的淀粉分支酶基因sbe2b和sbe1。并利用克隆出来的sbe2b和sbe1基因构建了表达载体,对玉米进行了转化研究。主要结果如下: 用大斑病菌对十叶期的玉米自交系48-2进行接种,接后6小时、30小时、54小时分别取接种植株和对照植株的叶片提取总RNA。采用荧光差异显示法对接种大斑病的玉米植株及对照植株的基因表达情况进行了比较,共回收了35个cDNA差异片段,其中13(dd1到dd13)个差异片段能再扩增出来,经反向Northern杂交检测,11个差异片段表现出差异,另外2个为假阳性。对11个差异片段进行克隆测序发现:cDNA差异片段dd1(ZMCCD1)与ABA生物合成中起关键作用的限速酶CCD基因有很高的同源性(80%)。cDNA差异片段dd2(ZKIN)与蛋白激酶SnRK基因有较高的同源性(85%)。并将ZMCCD1(编号:AY146585)和ZKIN(编号:AY146586)的序列提交到GenBank中。 从授粉15天左右的玉米胚乳中提取了总RNA,采用RT-PCR方法,克隆了玉米的淀粉分支酶基因sbe2b及sbe1全长cDNA,构建了sbe2b基因及sbe1基因cDNA的表达载体prEBE1、prEBE2。以玉米自交系501和先早17幼胚或愈伤组织为受体材料,以质粒prEBE1、prEBE2、35SIH3为外源DNA,用PDS-1000/He基因枪进行遗传转化。玉米幼胚为受体轰击了18皿,愈伤组织为受体轰击了28皿,历时2个月、经过3轮的除草剂抗性筛选,得到抗性愈伤组织204块。将抗性愈伤组织转移到分化培养基中,分化出再生植株,移栽到小花盆中的再生植株有36株。 PCR分子检测501、先早17再生植株(T0代)的10株,其中有8株扩增出0.5Kb的Bar基因的特异条带,5株扩增出2.4kb的sbe2b基因特异条带,3株扩增出2.5kb的sbe1基因特异条带。对PCR扩增的条带回收测序,测序结果与各自 的基因序列相符合,说明外源基因已经整合到玉米基因组中。 以玉米自交系501愈伤组织为受体,以带抗除草剂的bar基因的质粒35SIH3 为外源基因,比较了在进行基因枪转化前低温处理对基因枪转化效率的影响。结 果表明对愈伤组织进行4℃10小时的低温处理,然后在26t恢复培养4小时再进 行基因枪轰击,可以提高基因枪转化效率。对愈伤组织进行4’C10小时的低温处 理,不经过 26 C恢复培养 4小时而直接进行基因枪轰击,使基因枪的转化效率有 所降低。


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