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枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因在大肠杆菌中的表达及玉米表达载体的构建

邹立扣  
【摘要】:本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02中性植酸酶phyC基因为目的基因(GenBank Accession No.AY220075),在成熟肽序列之前设计上游引物,在终止密码子处设计下游引物(引入BamHⅠ/SalⅠ)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增,得到了大小约1.1kb的单一条带产物,获得phyC基因表达片段,将该产物与pUC18-T载体进行连接,酶切鉴定后,经BamHⅠ和SalⅠ酶切回收处理phyC片段,连接到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌JM109,在含100μg/ml的Amp抗性的LB平板上筛选后,经菌落PCR及酶切鉴定,获得阳性克隆菌株。用终浓度为0.1mM IPTG在含100μg/ml的Amp抗性的LB中诱导表达,酶活测定结果表明,表达产物具有植酸酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带,相对分子量(Mr)为69kD,30℃诱导3h后,表达的目的蛋白量占菌体总蛋白的47.4%。 在成熟肽序列之前设计上游引物,在终止密码子处设计下游引物(引入BamHⅠ/SacⅠ)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增,得到了phyC基因表达片段,将该产物与pUCm-T载体进行连接,酶切鉴定后,将该产物经BamHⅠ和SacⅠ酶切处理后连接到含有胚乳特异性启动子(EGH5 promoter)的中间载体pBPC47的多克隆位点上,转化大肠杆菌JM109菌株,在含100μg/ml的Amp抗性的LB平板上筛选到了的阳性菌落。质粒酶切分析和菌落PCR分析结果表明获得了pBPC-phyC重组质粒;在分析了pBPC47载体的基础上,选用了三酶切,先用BglⅡ和HindⅢ双酶切中间重组载体pBPC-phyC,再用Xhol单酶切,回收了三酶切片段,把启动子-phyC-终止子(EGH5-phyC-NOS)片段插入到经HindⅢ、BamHⅠ双酶切的表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点,转化大肠杆菌JM109后,经60μg/ml Kana抗性筛选、菌落PCR、质粒酶切鉴定后,筛选到了阳性转化菌落,质粒酶切分析结果表明获得了pB-C-phyC重组表达载体,并用基因枪法成功转化玉米愈伤组织。 本研究为中性植酸酶基因在微生物及植物中的高效表达奠定了良好的基础,具有重要的学术价值和应用前景。


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