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猪细小病毒(PPV-SC1)的分离、鉴定及其非结构蛋白NS1基因的克隆和序列分析

殷华平  
【摘要】:猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,猪细小病毒感染的主要特征是孕猪在怀孕前容易受到感染,可引起胚胎或胎儿的感染和死亡,导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡。PPV感染普遍存在于世界各地的猪群中,目前我国PPV的感染呈上升趋势。诊断、预防和控制PPV的流行对于我国的养猪业的发展具有重要的意义。 本文从流产的死胎及木乃伊胎中分离出了一株病毒PPV-SC1,该株病毒能在猪肾原代细胞、PK-15细胞、ST细胞和IBRS-2细胞上增殖并引起细胞病变,出现细胞的聚集、融合现象;分离毒能凝集0.5%的豚鼠红细胞,血凝效价可达1:2~(11),血凝抑制效价可达1:2~(10);荧光抗体染色在细胞核内和细胞质中均可见到特异性荧光,呈苹果绿色;电镜正染观察病毒粒子为无囊膜、球形、大小约23nm的病毒粒子。 根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2 kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建重组质粒pTNS1,对重组质粒pTNS1进行序列测定,测序结果显示PPV-SC1 NS1基因全长1989bp,包含完整的PPV-SC1 NS1基因的开放阅读框架,共编码662个氨基酸。 将PPV-SC1 NS1序列与其他PPV NS1基因进行多序列比对,结果显示,PPV-SC1 NS1与其他的PPV NS1的同源性较高,仅存在个别的差异,分别是第39位A→G,第153位T→C,第175位A→G,第1117位A→C,第1535位A→C;同源搜索比较表明,PPV-SC1与PPV NS1同源性可达98%、99%,与其他的细小病毒NS1基因也存在很大的保守性;密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性;PPV-SC1 NS1蛋白总体上说具有亲水性不存在明显的疏水性区段,用swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,返回的结果并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393-415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶C磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX_D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX_D5有类似的功能。


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